solexa测序原理及操作

单向测序
Paired-End Sequencing
双向测序
Indexed Sequencing
混合样品测序
3.1 Single-Read Sequencing
Single-Read Sequencing(SR, 单向测序)指只检测
基因片段一端的序列信息。
互补接头
接头
基因序列
接头
将被打断成几百个碱基（或更短），并在两个末
样品“种植”于检测 芯片(Flow Cell)中 并进行扩增。 GA 负 责 对 芯 片 内的基因片段进行 边合成边测序反应 (SBS)，收集碱基 信息。
新旧flow cell的对比： 1、进液孔的位置不变，新flow cell的管道直径增大至1.4mm 2、制造材质也有所不同
进样孔
出样孔
Single-Read Sequencing
将稀释好的样品加入Flow cell中，使用样品不FC上的接头 互补结合，使样品固定于FC中。经桥式PCR反应后使单分 子成簇。
Linearization & Blocking
对桥式PCR后的双链进行变性解链，并使用ddNTP对剩下 单链的未端进行阻断。
Sequencing Primer Hybridization
端加上接头(adapter)的基因片段按一定浓度进行 稀释。
将基因片段固定在芯片(Flow Cell)上。由于芯片表
面连接有一层单链引物(Primer)，经处理后的碱基 片段与芯片上的引物进行互补连接，被“固定” 在芯片上 。
引物扩增，以样品为亲本链，使芯片引物延长形
成复制链。
OH
diol
diol
CS扩增
这一步开始正式在Cluster Station机器上进行操作，具体 可以分为三个阶段：Hybridization & Amplification Linearization & Blocking Sequencing Primer Hybridization
Hybridization & Amplification
OH
Sequencing Second Read 第二端测序
Primer 加测序引物
Block with ddNTPs 阻断
P7 Linearization (fpg) 线性化
3.3 Indexed Sequencing
Indexed Sequencing是指将多种样品混合后进行
测序的技术。 这是为了充分利用solexa高通量的特点，有助于 降低成本。
Q&A
Q：如何判断一个RUN是否成功 A：密度 亮度 错误率 GC含量……
OH
Cluster 扩增完成
线性化
用ddNTP () 阻断
Primer 加测序引物
“DNA簇”在Genome Analyzer综合分析仪上进行
序列分析。通过SBS法，进行一次反应合成一个碱 基，读取一个数据。
通过拍照的方法进行捕获数据。每反应一次拍照
四次（A、C、G、T各一次）。
对取得的序列片段进行处理和拼接。
P7
P5
Grafted flowcell
Template Hybridization
Initial extension
Denaturation
芯片上的接头
模板杂交
第一链的延长
变性
U
U
U
U
U
U
U
U
1st cycle denaturation 变性
1st cycle annealing 退火 n=25 total
Y
X
TG C TAC GAT …
1 2 3 4 5 6
7
8
9
TTTTTTTGT…
3.2 Paired-End Sequencing
Paired-End Sequencing
(PE, 双向测序)是指检 测基因片段的两端序列 信息。
Single Read
Paired End
OH
OH
U
U U U U U U
3’5’-
…-5’
G T A T T T T C G G C A C A G A C T C T G T G A
Cycle 1:按顺序加入反应试剂 合成第一个碱基 清除未反应的碱基和试剂 激发碱基荧光并收集荧光信号 去除阻断基团和荧光基团 Cycle 2-n: 重复前面的步骤
CS 负 责 将 待 测
读长
时间（天）
密度
产量(GB)
准确率
1 x 36 bp 2 x 36 bp 2 x 45 bp 2 x 76 bp
~2.5 ~5 ~6.5 ~9.5
138-168 million 138-168 million 138-168 million 138-168 million
4.5-6 9.5-11.5 13.5-16.5 20.5-25
添加特定的测序引物，结束后可送往Genome Analyzer进 行测序
检查GA
在开始下一个RUN的测序工作前，首先会对GA进行清洗和检查。包 括清洗管道系统、排液测量、激光的状态……
安装Flow Cell
确认GA机器正常后，将经CS制备好的FC安放进GA内。这一步是GA 工作比较烦琐的一步，包括梯形棱镜的拭擦清理、FC的拭擦清理和添 加浸镜油这三步。为了丌对测序产生影响，棱镜不FC要非常干净，丌 得有一点尘屑；而添加浸镜油时更丌能让油沾到FC上。
≥99% ≥99% ＞98.5% ≥98.5%
5. Solexa 上机操作
C S
稀释样品→CS扩增→添加测序引物→送往GA测序
G A
检查GA→安装FC→First Base评估→开始测序
稀释样品
用于CS上机的样品首先经过QPCR检测浓度后根据任务单 上机密度的要求对样品进行稀释。这分为新库和旧库两种 情况：新库会根据以往类似样品的经验大概设定一个浓度； 旧库即是根据已经上机后的数据计算出相应的浓度。
Block with ddNTPs 阻断
Primer 加测序引物
OH OH
OH
SBS 进行测序
Sequencing First Read 第一端测序
Denaturation and De-Phosphorylation (PNK) 变性与去磷酸化
Resynthesis of P5 Strand 合成
First Base评估
在正式进行测序前会先进行一个first base测序测试，以便对这个 RUN有一个初步的了解。通过first Base可以了解到样品的密度、亮 度、均匀度等信息，以此来推测这个RUN的情况。
Q&A
Q：实验中有什么特别要注意的地方 A：定量准确 管道通畅 棱镜和FC擦拭干净 加浸镜油平稳 调焦精准
diol
diol
diol
diol
diol
diol
diol
diol
1st cycle 变性
1st cycle 退火
n=35 总数
1st cycle 延长
2nd cycle 变性
diol
diol
diol
diol
diol
diol
2nd cycle 延长
2nd cycle 退火
OH
OH
diol
OH
diol
diol
diol
diol
diol
diol
Flow Cell接头
P7
P5
模板杂交
延长
变性
剩下的复制链其一端“固定”在芯片上，另外一
端随机和附近的另外一个引物互补，被“固定” 住，形成“桥”(bridge) 。 形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在芯 片表面进行扩增，形成双链。 双链经变性成单链，再次形成桥，并作为下一轮 扩增的模板继续扩增反应 。 反复若干轮扩增，每个单分子得到了大量扩增， 成为单克隆“DNA簇群”。
Solexa 是 一 种 基 于 边 合 成 边 测 序 技 术
(Sequencing-By-Synthesis，SBS) 的 新 型 测 序方法。通过利用单分子阵列实现在小型 芯片(Flow Cell)上进行桥式PCR反应。由 于新的可逆阻断技术可以实现每次只合成 一个碱基，并标记荧光基团，再利用相应 的激光激发荧光基团，捕获激发光，从而 读取碱基信息。
1st cycle extension 延长
2nd cycle denaturation 再变性
U
U
U
U
U
U
2nd cycle extension 延长
2nd cycle annealing 退火
U
U
Cluster Amplification 扩增后的簇
P5 Linearization (USER) 线性化
Sample preparation
Cluster station
Sequencing
Data analysis
测序样
用CS对
对成簇
数据处
品的预
处理
Hale Waihona Puke Baidu
样品进
行扩增
后的样
品测序
理和拼
接
• GA与Solexa 2006年11月1日，illumina收购Solexa • GA：GAⅠ、GAⅡ、GAⅡⅩ GA升级频繁 • 1G→ 35G→ 50G GA最早被为1G analyzer，寓意其数据产 量为1G。