picbio 三代测序原理

三代测序之PacBio SMRT技术全解析2017-05-11 11:29 来源:基因谷技术

气温回升，天气渐暖，

花儿开了一簇又一簇~

在这美好的季节里，

我们准备聊点新话题。

今天小编要来和你分享：

PacBio SMRT测序那些事儿~

测序技术在近几年中又有里程碑的发展，Pacific Biosciences公司成功推出商业化的第三代测序仪平台，让三代测序正式走入我们的视线。与前两代相比，第三代测序有什么不同呢？今天小编带大家详细了解测序界新宠-PacBio SMRT测序平台。

PacBio SMRT测序原理

Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。基本原理如下：

聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部

4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部

荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光

荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基

统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列

酶反应过程中，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落

聚合反应持续进行，测序同时持续进行

PacBio SMRT测序原理

PacBio SMRT的单分子测序和超长读长是如何实现的？我们重点看一下该技术的两点关键创新：分别是零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs）和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上（Phospholinked nucleotides）。

SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小的区域，DNA聚合酶就被固定在这个区域。只有在这个区域内，碱基携带的荧光基团被激活从而被检测到，大幅地降低了背景荧光干扰。

SMRT Cell和ZMWs

将荧光染料标记在核苷酸的磷酸链而不是碱基上，当核苷酸掺入到新生的链中，标记基团就会自动脱落，减少了DNA合成的空间位阻，维持DNA链连续合成，延长了测序读长。SMRT测序最大限度地保持了聚合酶的活性，是最接近天然状态的聚合酶反应体系。

荧光标记在焦磷酸链上的核苷酸

PacBio SMRT测序送样要求

PacBio SMRT测序建库流程

DNA打断之后，经过末端修复、接头连接、片段筛选、杂交测序引物和聚合酶绑定，即可出库准备上机测序，建库过程无PCR反应。

PacBio SMRT建库流程

PacBio SMRT技术特点

PacBio SMRT技术有两种测序平台，RSⅡ和Sequel，应该如何选择？小编已将二者的对比表准备好啦~ 表3 RSⅡ和Sequel测序平台比较

Sequel平台与RSII平台相比具有很大的优势，Sequel平台测序通量高、单Gb数据成本低、周期短。

1.第三代基因测序技术又被为"Single Molecule Real Time (SMRT™) DNA

Sequencing"（单分子实时DNA测序技术），该方法基于纳米孔的单分子读取技术，不需要扩增即可快速读取序列。目前，Pacific Biosciences 公司已经成功推出了商业化的第三代测序仪PacBio RS平台，使得第三代测序正式走入人们的视角。

PacBio RS II是Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time, SMRT），其专利的SMRT Cell含有15,0 00个纳米级的零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs），每个ZMW 都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。

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技术特点

ü利用测序过程聚合酶反应的动力学变化，首次实现对碱基修饰进行直接测序。

ü超长的读长：平均测序读长能达到7,000-8,000bp，最长读长能达到3,0000bp；

ü准确率高：对基因组组装和基因组变异检测，可以最多达到99.999%的准确率；

ü敏感性强：可以检测频率在0.1%的minor variants；

ü无PCR扩增偏好性：样本不需要进行PCR扩增，避免了覆盖度不均一和PCR artifacts；

ü最小的GC偏好性（GC bias）：在极端高GC和极端低GC区域，可以轻松测定，从而保证序列的均匀覆盖度。

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数据产出

试剂盒平均读长数据量/SM RT Cell

P4-C2 Chemistry 5.5-6Kb ~200Mb

P5-C3 Chemistry 8-10Kb ~250Mb

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应用领域

（1）全基因组de novo测序

与二代测序最高不超过1kb的读长相比，PacBio RS II的长读长将有效解决短序列数据的拼接难题。同时，与二代测序的模板样品需要扩增相比，PacBio RS II无需扩增可直接对单个分子进行测序，有效避免了PCR扩

增偏好性和GC偏好性，PacBio RS II可轻松跨越GC含量异常（过高或过低）及高度序列重复的区域，实现序列覆盖的完整性和均一性。

（2）基因组草图的优化或基因组完成图绘制

对前期已开展测序的动植物、微生物基因组结合三代长读长测序数据进行完善和提升。针对前期已经开展全基因组测序，获得基因组草图的动植物、微生物等，可以结合PacBio RS II平台长读长reads进行补充，从而快速获得前期没有测得的信息及提升基因组的完整度。另外还可以针对前期没有检测获得的结构变异信息（structural-variation events）、串联重复序列信息（tandem duplication）、易位信息（Inversion）等。尤其在微生物基因组完成图的绘制中，可在一天之内、成本低于$1,000即可将基因组完善获得0 gap contig。

（3）全长转录本测序

PacBio RS II的长读长可实现全长转录本测序，并使基因可变剪接形式的识别成为可能，因此可以对新基因及其isoform进行更全面的研究。同时，长读长不再需要对RNA-Seq的reads进行组装，因此可以更完整的对基因模型和转录的基因进行更全面的注释，用以改进参考基因组中的基因注释信息。

（4）宏基因组测序

长读长reads能够更为精准地鉴定水体、土壤、肠道等生境中微生物的种类的鉴定，能够更加快捷地获得更多微生物种的全基因组序列。

（5）16S rDNA全长测序

PacBio RS II的平均读长为8-10Kb，而16S rDNA长度大约为1540bp，因此结合该平台测序可以成功测序获得16S的全长序列。

（6）细胞器基因组测序

叶绿体基因组和线粒体基因组序列都包含重复序列、反向重复序列等复杂结构，PacBio RS II的长读长可直接跨越这些区域获得这些细胞器的全