乳酸测定方法

乳酸的测定：

对羟基联苯比色法（参照高庆，2005）

1.材料、试剂与仪器

无水乳酸锂、对羟基联苯、钨酸钠、硫酸铜、氢氧化钙、浓硫酸、蔗糖、无水葡萄糖均为分析纯试剂。主要溶液：

①钨酸溶液：L硫酸及10%(W/V)钨酸钠(Na2WO4·2H2O)溶液等体积混合，当天使用前配制；

②20%(W/V)硫酸铜溶液：称取硫酸铜(CuSO4·5H2O)20g，加蒸馏水70ml，加热使之溶解，再加入蒸馏水定容至 100ml；

③对羟基联苯溶液：称取对羟基联苯溶于100ml 的L氢氧化钠溶液中( 配制时加热助溶，溶解后为澄清液体) ，贮存于棕色瓶中，保存于 4℃冰箱，可使用一个月；

④乳酸标准储存液(1mg/ml)：精确称取无水乳酸锂，溶于50ml 蒸馏水中，加 L 硫酸20ml，后加蒸馏水定容至 100ml，混匀后保存于 4℃冰箱。

⑤4%(W/V)硫酸铜溶液：20%硫酸铜溶液10mL加蒸馏水稀释至50mL。

⑥乳酸标准应用液(200µg/mL):使用时取储存液10mL用蒸馏水稀释至50mL。在冰箱中可保存数天。

主要仪器：

UNIC UV-2100 紫外可见分光光度计、TGL-16B 离心机、恒温水浴锅、具塞试管5ml及具塞比色管20ml。

2. 方法

青贮浸提液样品预处理

取适量青贮浸提液样品5000r/min离心10min，取上清液适当稀释，吸取稀释液于洁净离心管中，加入钨酸溶液，混匀，室温静置，直至溶液中出现明显絮状物（约30～45min），10000r/m 离心10min，取上清液置于5ml 洁净具塞试管中，60℃水浴保温30min 左右，冷却待用。

标准曲线的制作

①用200Lg/mL乳酸应用标准液

同青贮样品浸提液预处理方法一样预处理后(可以不稀释),按下表数量在预先编好号的试管中加入标准乳酸滤液和蒸馏水。

②各管中分别加入氢氧化钙粉末100mg,混匀,8000r/min离心5min,取上清液,加入预先加有20mg氢氧化钙粉末的小试管中,混匀,加 20%硫酸铜溶液,称重,迅速混匀,沸水浴3min,水浴冷却,补足重量,3000r/min离心5min,各吸上清液加入比色管中。③在各管加入25µL的4%硫酸铜溶液,混匀后置冰水浴内冷却。④将预冷的浓硫酸缓缓加入各管中,每管各加,边加边摇,混匀后置沸水浴中准确加热5min,取出后迅速置冰水浴中冷却3min左右。⑤在各管中加%对羟基联苯溶液,充分振摇后,放置,其间每10min混摇一次。⑥各管置于沸水浴中准确加热90s,立即放入冰水浴中冷却。在波长565nm处用lcm 比色皿,1管作为参比,分别测定吸光度(A)。所得数据以乳酸含量为横坐标,以565nm处的光吸收为纵坐标,作标准曲线。

青贮样品浸提液中乳酸含量的测定

取青贮样品浸提液滤液按标准曲线的测定方法,以蒸馏水为空白测定其在560nm处的光吸收,所得数据在标准曲线上查得相应的乳酸含量,即为青贮样品浸提液中的乳酸含量。

样品中乳酸含量=计算值×稀释倍数

需要试剂：

无水乳酸锂、对羟基联苯、钨酸钠、硫酸铜、氢氧化钙、浓硫酸、蔗糖、无水葡萄糖均为分析纯试剂。需要器材：

分光光度计、离心机、离心管、恒温水浴锅、具塞试管5ml及具塞比色管20ml。