核酸检测实验室建立与应用

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应用SAS9.0软件PROBIT分析结果
Analysis of Parameter Estimates Standard 95% Confidence Chi-
Parameter DF Estimate Error Limits Square Pr > ChiSq Intercept 1 -4.6852 1.5659 -7.7542 -1.6161 8.95 0.0028 log10(Dose) 1 4.8000 1.4699 1.9190 7.6810 10.66 0.0011
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Probit Analysis on Dose Probability Dose 95% Fiducial Limits
靶目标 酶
RNA MMLV逆转录酶及T7 RNA聚合酶
PCR 模拟自然 DNA复制的过程
DNA DNA聚合酶
反应体系
两种酶，两条引物，dNTP, NTP
一种酶，一对引物，dNTP
温度条件
扩增仪器 扩增产物
恒温（41.5℃ ） 水浴箱或者加热块
RNA
循环导热 （变性，退火，延伸）
热循环仪
DNA
扩增速度
合格标本发布结果
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待查标本复检
合格标本
不合格标本
单人份拆分 反应性标本
淘汰 不合格标本
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检测流程(2):常规筛查合格单人份标本检测流程
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检测流程(3):平行检测流程
常
规
检
样测
本
清
点 交
核 酸 单
接份
检
测
不合格标本 合格标本
阴性标本
反应性标本
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阳性或可疑 结果淘汰
核酸检测实验室建立与应用
卫生部临检中心深圳市血液中心血 液病毒核酸检测联合实验室 叶贤林
核酸扩增检测实验室的建立
人员 场地 检测方法选择 实wk.baidu.com方案
依据：卫生部颁发的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》
（卫医发[2002]10号）
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核酸实验室人员要求
资质:经过临检中心PCR培训班培训并取 得上岗证；通过血站核酸实验室岗前培 训考试合格。
PROBIT Pi=A+BXi
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用国际标准品稀释成不同浓度评估血液HBV 核酸筛查方法，结果如下。请计算95%的检 出限量及可信范围CI
序号 浓度 （IU/ml） 阳性数/重复数 概率
1
500
3/3
100
2
100
6/6
100
3
50
8/8
100
4
30
7/8
87.5
5
10
4/8
50
汇集拆分过程繁琐
拆分可减低非反应性比率
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核酸试剂质控
试剂的确认 试剂运输过程的控制(温度\条件\时限) 灵敏度的要求 内标的要求
试剂涵盖的基因型
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检测流程(1):常规筛查合格汇集标本检测流程
标本清点、离心 常规检测
合格标本 标本交接、电脑锁定
8 人份汇集 核酸提取 扩增检测 阴性标本
每个循环可以生成100-1000个复制物， 在15-30分钟内可增加10亿倍复制物
以2n扩增，2～3 h就能将待 扩目的基因扩增放大10亿倍
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TMA的优点
自动化程度高 灵敏度高
扩增效率高：10n
缺点
不能绝对定量
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PCR的优点
缺点
易于自动化 灵敏度高 扩增效率高
内标的作用 –质控整个反应。 –提示假阴性检测结果。 –监控反应的外部条件 –内标浓度要合适 –保持适度的内标失控.(<0.2%)
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核酸试剂灵敏度评估
概率单位回归分析 (PROBIT） 用于描述剂量-反应或不同因素间的剂量-
反应比较，反应结果应该是以二分类形式 表达的。 概率单位的回归方程为：
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核酸实验室污染后措施
实验室污染后，如何处理？
通风 次氯酸钠溶液（扩增区不宜使用） HCL溶液（吸头） 紫外线（固定、移动） 酒精喷洒（空气）
应设计有备用实验室 : 如开设独立的报 告发放区作为备用
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血筛核酸检测的内标的作用
中心理念：监测全程的实验过程包含病毒核 酸提取、反转录及扩增过程的效率。
培训:①无”核酸”的概念形成, ②防污 染的概念③良好工作习惯的培养. ④报告 的正确发放.
后备人员的培养.
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样本离心交接区
试剂准备区
核
酸
实
标本制备区
验
场
地 扩增区及扩增产物分析区
报告发放区
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方法选择: TMA与PCR
TMA
扩增原理 模拟自然 DNA 转录成 mRNA 的过程
合格标本发布结果
单项目反应性 无反应性
阳性或可疑 结果淘汰
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标准操作规程(SOP)的编写
核酸实验室设置与管理规范 核酸实验室标本检测流程 核酸实验室岗位职责 核酸实验室关键试剂管理规范 核酸实验室仪器设备管理规范 核酸实验室检测标本管理规范 核酸实验室室间质量评价规范 核酸实验室记录管理制度 核酸实验室生物防护规范 核酸反应性献血者追踪规程 核酸实验室检测应急措施
其他物品不得混用（例如：笔、纸张） 空气：试剂准备区→标本制备区→扩增区→产
物分析区 试剂阳性对照储存在标本制备区 使用带滤芯的吸头
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核酸实验室防污染措施
使用外排式的生物安全柜 自配试剂应分装成小规格，未用完的试剂应废
弃 使用次氯酸钠溶液消毒（台面、地面） 使用1mol/L的HCL溶液（吸头） 使用紫外线照射（空气和台面） 使用无水乙醇溶液（空气喷雾）
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核酸实验室防污染措施
主要的污染源
扩增产物 标本之间产生的气溶胶 操作人员
手 衣服
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核酸实验室防污染措施
要有独立的空气处理系统. 各区始终处于完全分隔的状态，不能有空气的
直接相通 实验室保持合理的通风 对各区内的设备、物料进行标示，专区专用；
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标准操作规程(SOP)的编写
核酸标本离心交接操作规程 核酸标本提取及汇集操作规程(科华) 核酸标本扩增检测操作规程（科华） 核酸标本全自动检测分析系统操作规程（CHIRON） 核酸标本检测报告发布操作规程（唐山软件） 核酸标本检测复检操作规程 生物安全柜标准操作规程 可移动紫外线灯标准操作规程 低温高速离心机标准操作规程 ABI 7300型核酸扩增荧光检测仪标准操作规程