硝基呋喃类药物检测(液质法).

表2 定性测定时相对离子丰度的最大允许变差
相对离子丰度 允许的相对偏差
＞50%
＞20%-＞50%
%
±30%
≤10% ±50%
（2）定量测定 按照内标法进行定量计算。
测定
（七）平行实验 按照以上步骤对同一试样进行平行实验测定。 （八）空白试验 除不称取试样外，均按照以上步骤进行。 （九）结果计算
1．甲醇：高效液相色谱级。 2．乙腈：高效液相色谱级。 3．乙酸乙酯：高效液相色谱级。 4．正己烷：高效液相色谱级。 5．浓盐酸。 6．氢氧化钠。
试剂和材料
7．甲酸：高效液相色谱级。 8．邻硝基苯甲醛，三水磷酸钾。 9．乙酸铵，0.2mol/L盐酸溶液：准确量取17ml浓盐酸，用水定容至1L， 2.0mol/L氢氧化钠溶液：准确称取80g氢氧化钠，用水溶解并定容至1L。 10．0.1mol/L邻硝基苯甲醛溶液：准确称取1.5g邻硝基甲醛，用甲醇溶 解并定容至100ml。0.3mol/L磷酸钾溶液：准确称取79.893g三水磷酸钾， 用水溶解并定容至1L。
试剂和材料
11．乙腈饱和的正己烷：量取正己烷80ml于100ml分液漏斗中，加 入适量乙腈后，剧烈振摇，待分配平衡后，弃去乙腈层即得。 12．0.1%甲酸水溶液（含0.0005mol/L乙酸铵）：准确量取1ml甲酸 和称取0.0386g乙酸铵于1L容量瓶中，用水定容至1L 13．标准物质：3-氨基-2恶唑酮、5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基 酮、1-氨基-乙内酰脲、氨基脲纯度>=99%
15．混合中间标准溶液：准确移取标准储备液各1ml于100ml容量瓶中， 用乙腈定容至刻度，配制成浓度为1mg/L的混合中间标准溶液，4℃冷藏 避光保存，有效期1个月。
试剂和材料
16．混合标准工作溶液：准确移取0.1ml。混合中间标准溶液于10ml，容量瓶 中，用乙腈定容至刻度，配制成浓度为0.01mg/L的混合标准工作溶液，4℃冷藏 避光保存，有效期1周。 17．内标储备液：准确称取适量内标物质（精确至0.0001g），用乙腈溶解，配 制成浓度为100mg/L的标准储备溶液，-18℃冷冻避光保存，有效期3个月。 18．中间内标标准溶液：准确移取中间内标标准溶液各0.1ml于10ml容量瓶中， 用乙腈定容至刻度，配制成浓度为0.01mg/L的混合内标标准溶液，4℃冷藏避光 保存，有效期1周。微孔滤膜：0.20μm有机相，氮气：纯度≥99.999%；氩气： 纯度≥99.999%。
按下式进行计算：
测定
式中： X——试样中分析物的含量，单位为微克每千克（ug/kg）。 R——样液中的分析物与内标物峰面积比值。 C——混合基质标准溶液中分析物的浓度，单位为纳克每毫升/ （ng/ml）。 V——样液最终定容体积，单位为毫升（ml）。 R3——混合基质标准溶液中的分析物与内标物峰面积比值。 M——试样的质量，单位为克（g）。 （十）测定低限（LOQ） 本方法的测定低限（LOQ）：AOZ\AOMZ\SEM\AHD均为0.5μg/kg。
样品处理
3. 混合基质标准溶液的制备 （1）肌肉、内脏、鱼、虾和肠衣 称取5份约2g、的阴性试样（精确至0.01g）于50ml塑料管中，加入10ml甲醇-水 混合溶液（1+1）体积比，振荡10min后，以4000r/min离心5min，弃去液体。残 留物中加入10ml 0.2mol/L盐酸，用均质器以10000r/min 均质1min后，按照最终 定容浓度：1、5、10、50、100 ng/mL，分别加入混合中间标准溶液或混合标准 工作溶液，再加入混合内标标准溶液100μL。
流动相A（乙腈） 10% 90% 90% 10% 10%
流动相B（4.16） 90% 10% 10% 90% 90%
测定
2．串联质谱条件 （1）定性测定 按照上述条件测定样品和混合基质标准溶液，如果样品的质量色谱峰保留 时间与混合基质标准溶液一致；定性离子对的相对丰度与浓度相当的混合 基质标准溶液的相对丰度一致，相对丰对偏差不超过表5.12的规定，则可 判定样品中存在相应的被测物。
样品处理
1. 水解和衍生化 （1）肌肉、内脏、鱼、虾和肠衣
称取约2g试样于50ml塑料离心管中，加入10ml甲醇-水混合溶液（1+1， 体积比），振荡10min后，以4000r/min离心5min，弃去液体。残留物中 加入10ml 0.2mol/L盐酸，用均质器以10000r/min均质1min后，再依次加 入混合内标标准溶液100μL邻硝基苯甲醛溶液100μL，涡动混合30s后， 再振荡30min，置37℃恒温箱中过夜16h反应。
测定
1. 液相色谱条件 （1）色谱柱：XTerra MS C18，150mm×2.1mm（内径），3.5μm或相当者。 （2）柱温：30℃。 （3）流速：0.2ml/min。 （4）进样量：10μL。 （5）流动相及洗脱条件见表1 。
表1 流动相及梯度洗脱条件
时间/min 0
7.00 10.0 10.01 20.00
试剂制备与保存
1．肌肉、内脏、鱼和虾：从原始样品去除有代表性样品约500g，用 组织捣碎机充分捣碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器中做为试 样，密封，并标明标记。将试样置于-18℃冷冻避光保存。 2．肠衣：从原始样品去除有代表性样品约100g，用剪刀剪成边长＜ 5mm的方块，混匀后均分成两份，分别装入洁净容器做为试样，密封， 并标明标记。将试样置于-18℃冷冻避光保存。
试剂和材料
14．内标物质：3-氨基-2恶唑酮的内标物，D4-AOZ；5-吗啉甲基-3氨基-2恶唑烷基酮的内标物，D5-AMOZ；1-氨基-乙内酰脲的内标物， 13C-AHD；氨基脲的内标物，13C15N-SEM，纯度大于等于99%。标准储备液： 分别准确称取适量标准品，用乙腈溶解，配制成浓度为100mg/L标准储 备液，-18℃冷冻避光保存，有效期3个月。
硝基呋喃类药物检测方法
高效液相色谱-质谱法
兽药残留检测
原理
样品经盐酸水解，邻硝基苯甲醛过夜衍生，调节pH值7.4后，用乙 酸乙酯提取，正己烷净化。分析物采用高效液相色谱/串联质谱定性检 测，采用稳定同位素内标法进行定量测定。
试剂和材料
除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
样品处理
（2）蛋、奶和蜂蜜 称取约2g试样（精确至0.01g）于50ml塑料离心管中，加入10ml-20ml 0.2mol/L 盐 酸 （ 以 样 品 完 全 浸 润 为 准 ） ， 用 均 质 器 以 10000r/min 均 质 1min后，再依次加入混合内标标准溶液100μL，邻硝基苯甲醛溶液，涡 动混合30s后，再振荡30min，置于37℃恒温箱中过夜16h反应。
试剂制备与保存
3．蛋：从原始样品去除有代表性样品约500g，去壳后用组织捣碎机 搅碎充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器做为试样，密封，并 标明标记。将试样置于4℃冷藏避光保存。 4．奶和蜂蜜：从原始样品取出有代表性样品约500g，用组织捣碎机充 分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器做为试样，密封，并标明标 记。将试样置于4℃冷藏避光保存。
仪器和设备
1. 液相色谱/串联质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI）。 2．组织捣碎机。 3．分析天平：感量0.0001g，0.01g。 4．均质器：10000r/min。 5．振荡器。 6．恒温箱。 7．pH计：测量精度±0.02ph单位。
仪器和设备
8．离心机：10000r/min。 9．氮吹仪。 10．漩涡混合器。 11．容量瓶：1L，100ml，10ml。 12．具塞塑料离心管：50ml。 13．刻度试管：10ml。 14．移液枪：5ml，1ml，100ml。
样品处理
2．提取和净化 取出样品，冷却至室温，加入1ml-2ml 0.3mol/L磷酸钾（1ml盐酸溶液加0.1ml磷 酸钾溶液）用2.0mol/L氢氧化钠调ph7.4后，再加入10ml-20ml乙酸乙酯（乙酸乙 酯加入体积与盐酸溶液体积一致），振荡提取10min后，以10000r/min离心10min， 收集乙酸乙酯层，残留物用10ml-20ml乙酸乙酯再提取一次，合并乙酸乙酯层。 收集液再40℃下用氮气吹干，残渣用1ml 0.1%甲酸水溶液溶解，再用3ml乙腈饱 和的正己烷分两次液液分配，去除脂肪。 下层水相过0.20μm微孔滤膜后，取10μL供仪器测定。