1-细胞生物学实验

五、实验操作



1. 取猪肝1g，放入小烧杯中，加4ml 0.25M蔗糖缓冲液， 将组织剪成约1mm立方的小块。 2. 将剪碎的组织移入匀浆器的外管中，再将内管（带柄 的活塞）插入外管中，缓慢而均匀地施力，上下旋转拉 动，匀浆7-10分钟，然后用六层纱布过滤回洗净的原烧 杯中。（这两步操作略） 3. 每组取1个5ml离心管，加入匀浆液 2ml，2000rpm离 心10分钟。（每组1管） 接下去的操作见下面的流程图。 健那绿染色：各取10μlD4悬浮液和健那绿染液在载玻片 上混合，10分钟后加盖玻片，观察线粒体。 改良苯酚品红染色：取10μlD6涂片，滴10μl改良苯酚品 红染液，5分钟后加盖玻片，观察细胞核。
2.细胞核的分离提取
3.高速离心分离提取线粒体
操作步骤 装有上清液的高速离心管→ 17000rpm 离心 20 分 钟 → 弃 上 清 ， 留 取 沉 淀 物 → 加 入 0．25mol／L蔗糖－0.003 mol／L氯化钙液1ml， 用吸管吹打成悬液→17000rpm离心20分钟→将 上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入 0.1ml 0． 25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙 溶液混匀成悬液→取上清液和沉淀物悬液，分 别滴于载玻片上，各滴一滴 0.02 ％詹纳斯绿 B 染液盖上盖片染20分钟→油镜下观察，颗粒状 的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。
(2) 镜台测微尺


1.外形是一载玻片，上有一带精细刻度的标尺。
2 . 总长度为 1mm，分为 100 等份，每一个格的长度为 0.01mm(10μm)。
(3)标定方法

①将镜台测微尺置镜台上。 ②低倍下找到镜台测微尺，使之与目镜测微尺平行且 左端对齐(0刻度重合)。

③由左向右找到目镜测微尺与镜台测微尺重合的位点， 分别记录两尺重合处的刻度，计算目镜测微尺每小格 的长度。
实验内容
一、动物细胞无丝分裂的观察——鸡血涂片
（一）原理
雷马克(Remak)于1841年最早在鸡胚血细胞中发现 血细胞分裂过程中没有出现纺锤丝和染色体的变化， 故称无丝分裂(Amitosis）
（二）结果与观察
处于分裂过程不同阶段的鸡血红细胞，核仁先行分裂， 向核的两端移动，细胞核伸长呈杆状；进而，在核的中部 从一面或两面向内凹陷，使核成肾形或哑铃形改变；最后， 从细胞中部直接收缩成两个相似的子细胞。
2.方法
取酵母悬液一滴于洁净玻片上，滴一滴0.2％亚甲基 蓝染液，加盖片，2分钟后于显微镜下观察细胞。 3.结果
死细胞被染成蓝色，活细胞不着色。
实验作业
画图记录细胞吞噬实验所见结果
实验三
细胞核与线粒体的 分级分离
实验用品
一、材料和标本 小白鼠
二、器材和仪器 玻璃匀浆器、普通离心机、台式 高速离心机、普通天平、光学显微镜、载玻片、 盖玻片、刻度离心管、高速离心管、滴管、 10ml 量筒、 25ml 烧杯、玻璃漏斗、解剖剪、镊子、吸 水纸、纱布、螬盘、平皿。
二、细胞有丝分裂的观察——马蛔虫子宫切 片
（一）原理
细胞有丝分裂 (Mitosis) 的现象是分别由施特拉斯布格 (Strasburger ， 1880) 在 植 物 细 胞 和 弗 勒 明 (Flemming ， 1882) 在动物细胞中发现。有丝分裂过程包括一系列复杂 的核变化，染色体和纺锤体的出现，以及它们平均分配到 每个子细胞的过程。
四、作业

1．绘制口腔上皮细胞(点线绘图法) 2．低倍镜、高倍镜下测微尺的标定方法及结果 3．计算核质比
镜台测微尺
目镜测微尺（200小格）
实验二、细胞生理活 动的实验观察
实验目的

通过制片与观察加深理解细胞吞噬等生理活动 掌握死活细胞鉴别的原理及方法
实验用品
1.材料：小白鼠
2.器材和仪器： 光学显微镜、 2ml注射器、载玻片、盖 玻片、解剖器材、滴管、牙签、吸水纸
蝗虫精巢取材方便，标本制备方法简单，染色体数目较 少，蝗虫初级精母细胞染色体数 2n=22+X ，经过减数分裂 形成四个精细胞，每个精细胞的染色体数为n=ll+X或n=11
三、试剂 0.25mol／L蔗糖－0.003mol／L氯化钙溶 液、 1 ％甲苯胺兰染液、 0.02 ％詹纳斯绿 B 染液、 0.9％NaCl溶液。
实验目的

1、了解分步离心分离细胞成分的方法原理。 2、学习、熟悉高速离心机的使用方法。
离心分离的原理
（一）实验原理 先用研磨、超声振荡、低渗等方法将组织或细胞破碎 （匀浆化），释放出细胞中的各种亚组分，再利用不同的 离心条件将它们分离出来，以供进一步分析研究之用。
如镜台测微尺1mm处(全长)与目镜测微尺75 刻度(150小格)重合，则:
1 目镜测微尺每小格的实际长度= 150 mm
=0.0067mm=6.7μ m
④同样的方法标定高倍镜下目镜测微尺 每小格的实际长度 计算公式如下: 目镜测微尺每小格的实际长度 30×10μm 镜台测微尺长度 ＝ ＝ 200 目镜测微尺格数
using of the microscope
(I) Use of low objective lens
(II) Use of high objective lens
Structure of the microscope Mechanical part Optics part Lighting part
处死小白鼠→取出肝脏，剪成小块→在盛有 0.9 ％ NaCl 的烧 杯 中 洗 涤 → 将 湿 重 约 1g 的 肝 组 织 放 在 平 皿 中 → 量 筒 量 取 8ml0.25mol／ L蔗糖－ 0.003mol ／ L 氯化钙溶液，先加少量该溶 液于平皿中→剪碎肝组织后，再全部加入→剪碎的肝组织倒入 匀浆管中研磨3～5次→ 用3层纱布过滤匀浆液于离心管中→将 装有滤液的离心管放入离心机2500rpm离心15分钟→缓缓取上清 液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，余下的沉淀 物进行下一步骤→用6ml0.25mol/L蔗糖－0.003mol／L氯化钙溶 液悬浮沉淀物，2500rpm离心15分钟→弃上清，将残留液体用吸 管吹打成悬液→ 滴一滴于载玻片上，自然干燥→ l％甲苯胺兰 染色后盖片即可观察。
(一)临时制片——口腔上皮细胞标本的制备

取载玻片一张 ( 揩净)→加一滴生理盐水→取材 ( 口腔内颊
部上皮细胞)→涂于生理盐水中→盖盖玻片→染色 ( 甲基
蓝)1’→观察
(二)显微测量

1．显微测量计
目镜测微尺 镜台测微尺
(1) 目镜测微尺


1.外形是一圆形玻片，装入目镜镜筒中。
用于测量标本用。 2. 刻度标记 0~100 ，实际分为 200 等份，每一个格的长 度需用镜台测微尺标定。
实验内容
实验一、细胞的形态结构与显微测量
实验二、细胞生理活动的实验观察
实验三、细胞核与线粒体的分级分离
实验四、细胞分裂的形态观察
实验五、细胞原代培养 实验六、细胞计数及死活细胞的鉴定
实验七、综合设计性实验
实验一
细胞的形态结构与显微测量
实验目的

(一) 观察并了解细胞的基本形态。 (二)掌握临时制片和显微绘图的方法。

1 、差速离心法：从低速到高速逐级沉淀分离，使较大的 颗粒先在较低转速中沉淀，再用较高转速将原先悬浮在上 清液中的较小颗粒分离沉淀下来，从而使各种亚细胞组分 得以分离。但由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离 心时是均匀分布于整个离心介质中的，各每级分离得到的 第一次沉淀必然不是纯的最重颗粒，须经反复悬浮和离心 加以纯化。 差速离心法主要用于分离细胞器和病毒。 其优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清夜与沉 淀分开，并可使用容量较大的角式转子。 缺点是：①分离效果差，不能一次得到纯颗粒；②壁效应 严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会 出现沉淀；③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会 使颗粒变形、聚集而失活。

2.方法
a．实验前二天，每天向小鼠腹腔注射 6％淀粉肉汤 0.5～ 1ml(含 O． 3％台盼兰，起标记作用 )，以刺 激腹腔产生较多的巨噬细胞。 b ．实验时，每组取一只经上述处理的小鼠，腹腔 注射 1 ％鸡血悬液 0.5 ～ 1ml ，注射后轻揉小鼠腹 部以使红细胞悬液分散均匀。 c．1小时后，用颈椎脱位法处死小鼠，迅速剖开小 鼠腹壁，向腹腔注入0.5ml～1ml生理盐水，用牙 签轻轻搅拌使生理盐水与腹腔液混匀。 d．用注射器抽取腹腔液，滴片，然后盖上盖片。
马蛔虫受精卵细胞：6条染色体
（二）观察
三、蝗虫精巢减数分裂压片标本的制备与观察
（一）原理
减数分裂(Meiosis) 是配子发生过程中的一种特殊有丝分 裂，即染色体复制一次，而细胞连续分裂两次，结果使染 色体数目减半的过程。减数分裂过程中体现了遗传三大定 律，所以说减数分裂在稳定种的遗传性状和繁殖中均起着 重要作用，是生物遗传与变异的细胞学基础。
(4)测量细胞并计算核质比

①口腔上皮细胞标本片→低倍镜下选无重叠、伸展良好、 结构完整的细胞→换高倍镜测量。 ②口腔上皮细胞为扁平形 ( 近似椭圆形 ), 测细胞的长半径 ( 直径 ) ，短半径 ( 直径 ) ，计算细胞体积。以同样方法测核 并计算核体积(或将核近似看作球形)。 ③按公式计算核质比。

(三)了解显微测微尺的原理及使用方法
实验用品
(一)材料：

人口腔上皮细胞(自取) 蛙血细胞涂片


人血涂片
单层柱状上皮细胞永久制片 骨骼肌纵切片
(二)器材：


载玻片
牙签 吸水纸
盖玻片
擦镜纸 纱布

永久制片
镜台测微尺
实验内容
临时制片——口腔上皮细胞标本的制备