分析人工髋关节置换术后骨溶解及假体松动的分子生物学机制(精)

分析人工髋关节置换术后骨溶解及假体松动的分子

生物学机制

[ 09-03-10 13:21:00 ] 作者：金山编辑：studa20

【摘要】目的探讨人工髋关节假体分离出的颗粒碎片刺激巨噬细胞而释放的肿瘤坏死因子(TNF-α)在人工髋关节术后引起骨溶解的作用机理。方法采用钛颗粒刺激巨噬细胞而释放TNF-α模型及酶联免疫吸附剂测定、蛋白质印迹、凝胶迁移率实验方法来研究其生物分子学机制。结果鼠类巨噬细胞受钛颗粒刺激而释放TNF-α，而JNK抑制剂 SP600125和 NF-кB抑制剂MG132 大大抑制了钛颗粒诱导的TNF-α释放，但p38抑制剂无此作用，甚至，钛颗粒诱导巨噬细胞而激活AP-1 和 NF-кB。结论钛颗粒诱导的TNF-α释放与JNK/AP-1及NF-кB通路有关。

【关键词】人工髋关节置换术钛颗粒骨溶解肿瘤坏死因子

【Abstract】 Objective To study the mechanism

of osteolysis after total hip replacement by tumor necrosis factor-α (TNF-α) release in macrophages stimulated with particulate debris from prosthesis. Methods A model of TNF-α release by stimulating macrophages with titanium particles was made and study the mechanism of TNF-α release by Elisa/West blot/EMSA. Results TNF-α was released in murine macrophage stimulated by titanium (Ti) particles and specific inhibitors of JNK (SP600125) and NF-κ B (MG132), but not p38 (SB203580) dramatically inhibited Ti-stimulated TNF-α release. Moreover,transcriptional activation of AP-1 and NF-κ B was also induced by Ti particles. Conclusion These results demonstrate that Ti particle-induced TNF-α release is mediated through JNK/AP-1 as well as NF-κ B pathways.

【Key words】 THR; Ti particles; osteolysis; TNF

人工髋关节置换术后假体周围的骨溶解及随后而来的假体疏松是置换术失败的常见原因。由于假体长时间磨损与腐蚀生成的颗粒碎片导致假体周围形成假膜，这些假膜由肉芽肿形成，它包括巨噬细胞、纤维母细胞、巨细胞及破骨细胞［1，2］。假体周围膜组织的这些细胞受这些碎片颗粒而产生有关骨溶解及假体松动的炎症因子如TNF-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-11及转化生长因子-β［3，4］。通过这些细胞因子的相互作用，破骨细胞被激活吸收骨组织，导致骨溶解及假体松动。

这些炎症因子中，TNF-α是很重要的骨溶解因子。Kimble 等已证明TNF-α可以增强成骨细胞NF-кB配位子（RANKLE）受体及巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)受体活性［5］。而且，Ingham 等发现TNF-α又直接促进早破骨

细胞分化并激活成熟的破骨细胞吸收骨组织［6］。与此同时, Merkel 等通过去除肿瘤坏死因子受体（TNFR）基因的动物颅骨与PMMA 颗粒接触，发现无骨溶解现象［7］。这些结果显示，TNF-α是人工关节术后磨损颗粒导致的骨溶解重要细胞因子。但至今,尚未报告与此相关的分子生物学机制。本次实验,通过鼠巨噬细胞受钛颗粒刺激而释放的TNF-α模型来分析TNF-α合成的分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM培养基，牛胎血清（FBS）来自于Gibco Invitrogen 公司（Rockville.MD）。PD98059、SP600125、MG132 来自于Calbiochem (La Jola CA)。抗磷酸-ERK /JNK/IkBα抗体来自于Cell Signaling Technology(Beverly,MA)。测定鼠TNF-α ELISA 试剂盒来自于BioSource international(Madison WI)。EGCG 来自于Sigma (St

Louis,MO)。硝基纤维膜及化学法光试剂盒来自于Amershan Biosciences Corperation(Piscataway,NJ)。其余化学试剂来自于Sigma公司。

1.2 细胞培养 RAW264.7 细胞培养在由10% FBS 及1% 青链霉素添加的DMEM 培养基以及5％CO2湿润的37°C空气中，等生长到60%～70%后计数并培养在96孔培养皿（2×104细胞/孔）或60mm 组织培养皿(2×106细胞皿)，然后，细胞与已知浓度的PD98059、SP600125、MG132处理30min后，再与钛颗粒处理。上清液及细胞收集后用于进一步分析。

1.3 钛颗粒准备钛颗粒（1～3μm）来自于

Cerac(Milwaukee,WI)。颗粒用25％硝酸及95％乙醇、0.1N氢氧化钠混合液消毒（Ragab et al,1999）。颗粒内毒素由Limulus Amebocyte Lysate 方法（Biowhittaker,Walkersville,MD）测定。

1.4 方法

1.4.1 ELISA （酶联免疫吸附剂测定） RAW264.7细胞（2×104/孔）在PD98059/SP600125/MG132 等抑制剂添加或不添加的情况下用钛颗粒处理。TNF-α用ELISA 方法（BioSource）来测定。具体如下：将稀释好的包被抗体加入ELISA板，100μl/孔，4℃放置24～48h。洗涤液冲洗ELISA板3次，加待测样品、阴性对照及倍比稀释的标准品，100μl/孔，37℃，1h。标准品稀释方法：取标准品，溶于100μl标准品稀释液中做1:100稀释为10ng/ml 以后再倍比稀释至78pg/ml，即：10ng/ml、5ng/ml、

2.5ng/ml、1.25ng/ml、625pg/ml、312pg/ml、156pg/ml、78pg/ml。洗板3次，加入稀释好的酶标抗体，100μl/孔，37℃，1h。洗板3次，加入配好的ABTS显色液，100μl/孔，室温或37℃显色15～30min。ELISA读数仪测450nm/650nm处OD值，绘制标准曲线。

1.4.2 Wetern blot(蛋白质印迹) 将RAW264.7细胞用钛颗粒处理后，置于含有酶抑制剂的细胞溶解缓冲液(150mmol/L NaCl、1NP-40、0.5去氧胆酸及50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0)中，室温下1h，离心