分析人工髋关节置换术后骨溶解及假体松动的分子生物学机制(精)

分析人工髋关节置换术后骨溶解及假体松动的分子生物学机制[ 09-03-10 13:21:00 ] 作者：金山编辑：studa20【摘要】目的探讨人工髋关节假体分离出的颗粒碎片刺激巨噬细胞而释放的肿瘤坏死因子(TNF-α)在人工髋关节术后引起骨溶解的作用机理。

方法采用钛颗粒刺激巨噬细胞而释放TNF-α模型及酶联免疫吸附剂测定、蛋白质印迹、凝胶迁移率实验方法来研究其生物分子学机制。

结果鼠类巨噬细胞受钛颗粒刺激而释放TNF-α，而JNK抑制剂 SP600125和 NF-кB抑制剂MG132 大大抑制了钛颗粒诱导的TNF-α释放，但p38抑制剂无此作用，甚至，钛颗粒诱导巨噬细胞而激活AP-1 和 NF-кB。

结论钛颗粒诱导的TNF-α释放与JNK/AP-1及NF-кB通路有关。

【关键词】人工髋关节置换术钛颗粒骨溶解肿瘤坏死因子【Abstract】 Objective To study the mechanismof osteolysis after total hip replacement by tumor necrosis factor-α (TNF-α) release in macrophages stimulated with particulate debris from prosthesis. Methods A model of TNF-α release by stimulating macrophages with titanium particles was made and study the mechanism of TNF-α release by Elisa/West blot/EMSA. Results TNF-α was released in murine macrophage stimulated by titanium (Ti) particles and specific inhibitors of JNK (SP600125) and NF-κ B (MG132), but not p38 (SB203580) dramatically inhibited Ti-stimulated TNF-α release. Moreover,transcriptional activation of AP-1 and NF-κ B was also induced by Ti particles. Conclusion These results demonstrate that Ti particle-induced TNF-α release is mediated through JNK/AP-1 as well as NF-κ B pathways.【Key words】 THR; Ti particles; osteolysis; TNF人工髋关节置换术后假体周围的骨溶解及随后而来的假体疏松是置换术失败的常见原因。

由于假体长时间磨损与腐蚀生成的颗粒碎片导致假体周围形成假膜，这些假膜由肉芽肿形成，它包括巨噬细胞、纤维母细胞、巨细胞及破骨细胞［1，2］。

假体周围膜组织的这些细胞受这些碎片颗粒而产生有关骨溶解及假体松动的炎症因子如TNF-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、白细胞介素-8、白细胞介素-11及转化生长因子-β［3，4］。

通过这些细胞因子的相互作用，破骨细胞被激活吸收骨组织，导致骨溶解及假体松动。

这些炎症因子中，TNF-α是很重要的骨溶解因子。

Kimble 等已证明TNF-α可以增强成骨细胞NF-кB配位子（RANKLE）受体及巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)受体活性［5］。

而且，Ingham 等发现TNF-α又直接促进早破骨细胞分化并激活成熟的破骨细胞吸收骨组织［6］。

与此同时, Merkel 等通过去除肿瘤坏死因子受体（TNFR）基因的动物颅骨与PMMA 颗粒接触，发现无骨溶解现象［7］。

这些结果显示，TNF-α是人工关节术后磨损颗粒导致的骨溶解重要细胞因子。

但至今,尚未报告与此相关的分子生物学机制。

本次实验,通过鼠巨噬细胞受钛颗粒刺激而释放的TNF-α模型来分析TNF-α合成的分子生物学机制。

1 材料与方法1.1 材料 DMEM培养基，牛胎血清（FBS）来自于Gibco Invitrogen 公司（Rockville.MD）。

PD98059、SP600125、MG132 来自于Calbiochem (La Jola CA)。

抗磷酸-ERK /JNK/IkBα抗体来自于Cell Signaling Technology(Beverly,MA)。

测定鼠TNF-α ELISA 试剂盒来自于BioSource international(Madison WI)。

EGCG 来自于Sigma (StLouis,MO)。

硝基纤维膜及化学法光试剂盒来自于Amershan Biosciences Corperation(Piscataway,NJ)。

其余化学试剂来自于Sigma公司。

1.2 细胞培养 RAW264.7 细胞培养在由10% FBS 及1% 青链霉素添加的DMEM 培养基以及5％CO2湿润的37°C空气中，等生长到60%～70%后计数并培养在96孔培养皿（2×104细胞/孔）或60mm 组织培养皿(2×106细胞皿)，然后，细胞与已知浓度的PD98059、SP600125、MG132处理30min后，再与钛颗粒处理。

上清液及细胞收集后用于进一步分析。

1.3 钛颗粒准备钛颗粒（1～3μm）来自于Cerac(Milwaukee,WI)。

颗粒用25％硝酸及95％乙醇、0.1N氢氧化钠混合液消毒（Ragab et al,1999）。

颗粒内毒素由Limulus Amebocyte Lysate 方法（Biowhittaker,Walkersville,MD）测定。

1.4 方法1.4.1 ELISA （酶联免疫吸附剂测定） RAW264.7细胞（2×104/孔）在PD98059/SP600125/MG132 等抑制剂添加或不添加的情况下用钛颗粒处理。

TNF-α用ELISA 方法（BioSource）来测定。

具体如下：将稀释好的包被抗体加入ELISA板，100μl/孔，4℃放置24～48h。

洗涤液冲洗ELISA板3次，加待测样品、阴性对照及倍比稀释的标准品，100μl/孔，37℃，1h。

标准品稀释方法：取标准品，溶于100μl标准品稀释液中做1:100稀释为10ng/ml 以后再倍比稀释至78pg/ml，即：10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、625pg/ml、312pg/ml、156pg/ml、78pg/ml。

洗板3次，加入稀释好的酶标抗体，100μl/孔，37℃，1h。

洗板3次，加入配好的ABTS显色液，100μl/孔，室温或37℃显色15～30min。

ELISA读数仪测450nm/650nm处OD值，绘制标准曲线。

1.4.2 Wetern blot(蛋白质印迹) 将RAW264.7细胞用钛颗粒处理后，置于含有酶抑制剂的细胞溶解缓冲液(150mmol/L NaCl、1NP-40、0.5去氧胆酸及50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0)中，室温下1h，离心10min(13000r/min)，取上清液，检测蛋白浓度。

将同一蛋白浓度的待测标本、阳性对照及阴性对照样本煮沸3min，分别加入4%～15% 十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶，电泳45～60min(电压200V)。

将带有蛋白带的凝胶转移至硝酸纤维膜，在90V电压下转移1h，将其置于5%无脂牛奶中1h(去除非特异性染色)后取出，加第1抗体-ERK/JNK/IkBa(抗体稀释液：1%小牛血清、Tris盐溶液、0.5 Tween 20)于硝酸纤维膜，4℃过夜，漂洗3次后加HRP标记的抗1抗体，再置室温1h，漂洗3次，用放射自显影法显影，Kodak X胶片摄影。

Western blot方法显示的蛋白带密度直观进行比较。

1.4.3 EMSA(凝胶迁移率实验) Park方法准备细胞核提取液［8］。

蛋白浓度用BCA试剂盒测定。

凝胶迁移测定方法按Promega 公司说明书进行。

7μg 核抽提液与1μg poly d(I-C)含50，000～100，000 cpm 32P标记的AP-1/ NF-κB置25μg的结合缓冲液（10mM Tris.HCl, pH 7.5, 100mM NaCl, 1mM DTT, 和4% glycerol）于室温30min。

形成的复合物在0.5xTBE缓冲液(50mM Tris. HCl, pH8.5, 50mM borate,和1mM EDTA)的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，并凝胶在真空中变干60min后 X 胶片摄影。

1.4.4 统计学方法统计分析用SPSS11.0并完全随机设计的单因素方差分析。

P <0.05具有意义。

2 结果2.1 钛颗粒刺激后由时间及剂量依赖性释放TNF-α为确定RAW264.7细胞在何有效浓度的钛颗粒才能释放TNF-α，选择了三种不同浓度的钛颗粒并与RAW264.7细胞混合。

取其上清液用ELISA法测定TNF-α。

图1示三种浓度的钛颗粒剂量依赖性释放TNF-α，图2示0.02% 浓度钛颗粒刺激后时间依赖性释放TNF-α。

2.2 ERK/p38/JNK/NF-к B 抑制剂对RAW264.7细胞受钛颗粒刺激而释放的TNF-α的效果为了解RAW264.7细胞受钛颗粒刺激而释放TNF-α与哪支细胞信号通路有关，细胞先由ERK/p38/JNK/NF-к B 抑制剂处理后，再受0.002%钛颗粒刺激24h。

用ELISA法测定其上清液中的TNF-α。

与对照组（651.5±9.3pg/ml)相比，30μM PD98059, 25μM SB203580, 20μM SP600125, and 10μM MG132 各抑制TNF-α66% (218.2±21.1pg/ml), 20%(550±5pg/ml), 91% (56±6pg/ml) and 92% (51.3±4.7pg/ml) (P<0.01) (见图3) 。

其中JNK抑制剂（SP600125）及NF-к B 抑制剂（MG132）显示较强的抑制作用。

图3 ERK1/2、JNK及NF-кB抑制剂对RAW264.7。