淋巴细胞转化试验(MTT)
MTT方法测定脾淋巴细胞转化(20070727)
MTT方法测定脾淋巴细胞转化实验1.实验步骤：1.1.调整淋巴细胞浓度：a)小鼠断颈椎处死后，放入75%酒精液浸泡5min；b)用无菌镊子取出小鼠，手术剪剪开腹腔，取脾脏，以1ml无菌注射器将脾在研钵中磨碎，用3.5ml预冷的Hank’s液悬浮，过筛入无菌平皿，研钵中再次加入3.5ml Hank’s液，过筛入平皿，将7ml细胞悬液移入塑料离心管；c)离心1500rpm, 5min；d)用Hank’s液洗2次；e)以2ml完全培养液悬浮细胞，转0.1ml细胞入3.9ml 1.5%冰醋酸，混匀后计数；其余细胞均放于4℃冰箱预冷，防止细胞死亡；f)根据细胞计数，调整细胞浓度到1*107/ml。
（假定4个大方格内总数为N，则该细胞悬液的浓度为n=105*N）1.2.刺激物的配备用细胞培养液将各种培养刺激物按2*终浓度稀释，混匀。
以100μl/孔加入96孔细胞培养板中。
（PHA和ConA主要刺激T淋巴细胞增殖，LPS主要刺激B细胞增殖。
）ConA 的常用浓度为0.1-15μg/ml，LPS的常用浓度为0.1-10μg/ml , 具体情况要根据细胞浓度和反应时间而定。
不同品种的动物也有一定的不同。
1.3.加样在以上各孔中加入工作浓度的淋巴细胞悬液100μl/孔（边加边摇匀，防止滴加过程中淋巴细胞发生沉淀。
细胞培养板具体设计根据具体试验而定，设培养液对照孔。
1.4.培养将96孔细胞培养板放入细胞培养箱，培养72小时。
每过24小时需取出细胞培养板，在倒置显微镜中查看培养孔中是否出现细菌污染。
1.5.MTT培养结束前4小时，以50ul/孔添加MTT稀释液，继续培养至72小时。
1.6.处理停止细胞培养，离心（1500rpm，10min）使淋巴细胞沉淀，轻轻倾去细胞培养液，纸巾吸干。
加入DMSO，150ul/孔。
充分振荡后，避光放置10-15min（直至蓝色颗粒充分溶解）1.7.检测充分振荡后，570nm单波长酶标仪检测。
淋巴细胞转化试验(MTT)
一、淋巴细胞转化试验（MTT）（一）原理：四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。
当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。
（二）材料：MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。
用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。
丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原（三）方法：1、脾细胞制备：（1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；（2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；（3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。
放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；（4）制备脾细胞悬液①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min 5-10min， (或1500rpm，4-7min)。
取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。
调整细胞浓度为5 105/ml。
②梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；③酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入400u/ml胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。
医学免疫实验(T细胞增殖实验、核素法、MTT法)
3H胸腺嘧啶核 苷掺入检查法
3H胸腺嘧啶核苷掺入检查法
原理：当淋巴细胞受分裂原(PHA等)或特异性抗原刺激发生转化时， 必然伴有DNA的大量合成，若将具有放射性的3H-TdR加到培养液内， 则可被作为合成DNA的原料而摄入转化中的细胞内，测定细胞内放 射性物质的相对数量(以脉冲数cpm表示)，就能客观地反映淋巴细 胞对刺激物的应答水平。
MTT法
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活 性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞 毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它 的特点是灵敏度高、经济。
淋巴细胞的功能测定技术
T细胞+PHA
培养，淋巴母细胞转化
染色 +3H-TdR
计数转化细胞百分率 测定cpm值
测定OD值
谢谢！
医学免疫实验
作业
市场上有一广告产品，据说有免疫 增强作用，请设计一个方案证实之 （从影响淋巴细胞功能、T淋巴细 胞增殖的角度考虑）。
T细胞增殖实验 3H胸腺嘧啶核苷掺入检查法（核素法） MTT法
T细胞增殖实验
原理：又称T细胞转化试验。T细胞在体外经某种物质刺 激，细胞代谢和形态相继变化，在24~48h细胞内蛋白质 和核酸的合成增加，产生一系列增殖的变化，如细胞变 化、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松 等，由淋巴细胞转变为淋巴母细胞。因此，这种淋巴细 胞增殖又叫淋巴细胞转化。据此可判断出淋巴细胞对有 关刺激的反应性与功能状态。 (1) 非抗原性刺激物:如植物血凝素(PHA)、刀豆素 A(ConA)、美洲商陆(PWM)、脂多糖(LPS)，通称促有丝分 裂原。其中LPS刺激B细胞，PWM可刺激T和B细胞，PHA和 ConA刺激T细胞增殖。 (2) 抗原性刺激物:如结核菌素、葡萄球菌毒素、破伤风 类毒素、链球菌激酶、肿瘤抗原、同种异型组织抗原等。
MMT
实验步骤
1. 无菌制作脾细胞悬液 1）无菌条件下取试验各组脾脏 2）在盛有10 ml 4℃ Hank's液的烧杯中 将脾以眼科剪剪碎 , 经200 目尼龙网轻柔研磨后过筛 , 收 集细胞悬液, 将滤液以1 500 r/min 离心5 min。 3）倒去上清液体, 观察沉淀细胞体积。以10:1 体积比 加入红细胞裂解液混匀。 4）静置2 min 后, 立即加入4 ℃ 10 ml Hank's液, 以 1 500 r/ min 离心5 min。 5）倒去上清液体, 用Hank's液反复洗涤细胞2 次。 6）最后一次离心前进行细胞计数 , DMEM培养基重悬细 胞, 调整细胞浓度为5×10^6/ ml
MTT法：活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶 以MTT为底物，形成蓝色的甲臜 （ Formazan ）颗粒沉积于细胞内或细 胞周围，经 DMSO 溶解后为紫色溶液， 可用酶标测定仪测定 OD570 的值 , 来间 接反映活细胞数量。
ConA 刺激淋巴细胞 → 出现淋巴细胞转 化现象→加入MTT→活化的淋巴细胞使 外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结 晶甲瓒 → 二甲基亚砜溶解细胞中的甲 瓒→酶联免疫检测仪在570nm波长处测 定其OD值
预பைடு நூலகம்结果：
淋巴细胞悬液的制备 : 无菌取肝素抗凝外周血 5 ml, 沿管壁缓慢加入到含 6 ml淋巴细胞分离液的 离心管中 ,两液之间形成界面 ; 2 000 r/min 离 心 20 min, 收集分离液界面上富含淋巴细胞的液 体加于另一离心管中 , 1 000 r/min离心 7 min, 弃上清 ; 淋巴细胞用 Hank's 液洗涤二次后加入 DMEM完全培养液 ,配制成细胞数 5 × 10^6 /ml 的单细胞悬液。（ Hank's 液是一种平衡盐溶液， 主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的 漂洗、配制其他试剂等）
T淋巴细胞转化试验步骤及注意事项
淋巴增殖实验:第一种，取外周血和脾脏分离淋巴细胞用于淋巴增殖实验,具体步骤如下⑴雏鸡翅下釆血2mL,加入1mL抗凝血和1mLPBS的混合液,混合均匀后,缓缓加入装有2mL淋巴细胞分离液的无菌透明的大离心管中,不要摇晃,注意血液与淋巴细胞分离液不要混合,2000rpm,离心20min,可以看见中间有层白色雾状白细胞,吸取白细胞至2inL离心管中,2000rpm离心5min取沉淀;(2)向离心管中加入1mL 1640清洗2遍,2000rpm离心5min取沉淀;⑶将沉淀悬于1mL DMEM,细胞计数板计数,取 1 xlO7个细胞悬于ImLPBS中,置于37°C培养箱中用CFSE (终浓度2gM)避光染色lOmin,每隔2-3min上下颠倒一次;(4)DMEM洗漆细胞2次,每次1mL,2000rpm离心6-7min;(5)悬于1mL DMEM 中;(6)取5xl05个细胞置于96孔板,同时加入20μ30μg/m的ConA,DMEM补齐至200μL,4℃二氧化碳培养箱诱导3d;(7)流式专用buffer洗涤2次,2000r离心5min,200μbuffer悬起,流式细胞仪检测。
取1小块脾脏加入1mL 1640研磨,脾脏细胞先用200μL红细胞裂解液作用5min,2000rpm离心5min,计数,之后重复上述步骤。
第三种，外周血液 T、B 淋巴细胞增殖功能测定——MTT 测定法1. 外周血液淋巴细胞悬液的制备无菌采取外周血液，以淋巴细胞分离液密度梯度离心法(2000r/min，20min)分离淋巴细胞，再用 RPMI1640 培养液离心洗涤(1500r/min，10min)淋巴细胞 3 次，用台盼兰拒染法检测细胞活率＞95％，同时进行细胞计数，用 RPMI-l640 完全培养液调细胞浓度至1×107/ml。
2. 外周血液 T 淋巴细胞增殖功能测定于 96 孔微量培养板每孔加入50µl含20µg/m1 ConA 的 RPMI1640 培养液，对照孔只加 RPMI1640 培养液。
mtt检测法原理
mtt检测法原理
MTT检测法原理是一种常用的细胞活力测定方法。
MTT指的是3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物，它在体外实验中被广泛用于评估细胞的代谢活性和细胞增殖能力。
MTT检测法的原理基于细胞内的代谢酶将MTT转化为可溶性紫色形式维琴偶体，即紫色结晶体。
这个转化反应是可逆的，只发生在活细胞内。
MTT检测法的步骤如下：
1. 首先，将要测试的细胞均匀地种植在培养基中的孔板或细胞培养瓶中。
2. 待细胞附着生长后，加入MTT试剂并与细胞一同孵育一段时间，通常是2-4小时。
在此期间，细胞的代谢酶会将MTT转化为紫色维琴偶体。
3. 孵育结束后，用某种适当的溶液，如二甲基亚砜（DMSO），将维琴偶体溶解。
4. 最后，测量溶液中的紫色的吸光度。
吸光度的读数与细胞内MTT转化的数量成正比，可以用来评估细胞的活力。
MTT检测法具有灵敏度高、操作简便、结果稳定等优点，因此在生物医学研究和药物筛选中被广泛应用。
通过使用MTT检测法，可以快速、可靠地评估细胞的生命活力以及药物对于细胞增殖的影响。
淋巴细胞转化实验
人T细胞
人B细胞
小鼠T细胞
小鼠B细胞
刀豆蛋白A（ConAn）
+
_
+
_
植物血凝素（PHA）
+
_
+
_
美洲商陆（PWM）
+
+
+
+
脂多糖（LPS）
_
_
_
+
葡萄球菌A蛋白菌体（SAC）
_
_
_
+
B
A
C
分离人外周血单个核细胞（PBMC）
淋巴细胞转化试验
分离人淋巴细胞(磁珠分离，流式细胞术)
实验流程
实验流程 －PBMC的分离 基本原理：由于血液标本中各种细胞比重不同，红细胞、中性粒细胞比重为1.092，单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）比重为1.075－1.090；Ficoll比重为1.077±0.001。将血液标本置于分层上，经离心沉淀，比重高的红细胞、多核白细胞沉于管底，而比重小的淋巴细胞和单核细胞悬浮于血浆和分层液的界面层中。
细胞培养技术
细胞培养（cell culture）：从体内取出组织或细胞，在体外模拟体内的生理环境，在无菌、适宜温度和一定营养条件下使其生长，并维持其结构和功能的方法。
细胞培养技术是生命科学中常用的研究手段，亦是生命科学各研究领域的基础技术和基本技能。
细胞培养概述
细胞培养实验的基本要求
实验前准备：超净台紫外线消毒30min；无菌室每周消毒1-2次；所用器材要经过严格消毒；操作前用冻存
细胞的复苏
细胞的运输
细胞的冻存、复苏与运输
细胞培养常见污染及处理方法
细菌污染
处理: 将污染孔内液体弃掉，加入硫酸铜或5mol/L NaOH; 重要克隆洗涤数次后,大剂量联用抗生素效果较好; 反复洗涤后注射到小鼠腹腔中(限用于某些细胞)
MTT实验原理步骤注意事项
MTT实验原理步骤注意事项MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide）实验是一种间接法测定细胞的代谢活性的方法。
MTT是一种黄色的溶液，在细胞内会被活细胞的线粒体内还原为紫色的结晶形式。
这些紫色结晶通过一定的溶解步骤转变为紫色的溶液，并使用酶标仪测量其吸光度。
吸光度的变化可以反映细胞的增殖和活性水平，从而评估药物或物质的细胞毒性。
1.细胞培养：选择需要研究的细胞株，并使用细胞培养基将其培养至对数生长期。
2.细胞接种：将对数生长期的细胞用细胞培养基洗涤，获得单细胞悬浮液，并在96孔板中接种相应的细胞密度。
3.处理药物：根据实验需求，选择适当浓度的药物或化合物，并将其加入每个孔中。
4.处理时间：根据需求和实验目的，将药物处理时间设定为不同的时间段。
5.加入MTT溶液：在处理药物和处理时间后，将MTT溶液加入每个孔中，并使其充分与细胞接触。
6.溶解晶体：处理一段时间后，将培养基和MTT溶液完全吸取，然后添加溶解晶体溶液，使晶体溶解。
7.检测吸光度：待溶解晶体完全溶解后，使用酶标仪测量每个孔的吸光度，并将结果记录下来。
8.数据分析：根据吸光度的变化，可以计算得到药物对细胞的毒性，评估药物或物质的效果。
1.培养条件：选择合适的细胞培养基和培养条件，确保细胞能够保持良好的生长状态。
2.细胞密度：将细胞密度恰当控制在合适范围内，避免过度或不足，影响实验结果。
3.药物浓度：选择适当的药物浓度范围，避免浓度过高或过低，影响实验的结果。
4.处理时间：根据需求和实验目的，选择合适的处理时间，使药物对细胞产生明显的影响。
5.溶解晶体溶液：使用溶解晶体溶液时，要充分搅拌使晶体完全溶解，避免气泡产生。
6.数据分析：对实验结果进行正确的数据分析，根据实验的目的和要求进行合理解读。
总结：MTT实验通过将MTT溶液与细胞相互作用，最终通过吸光度的变化来评估药物或物质的细胞毒性。
T淋巴细胞转化实验 ppt课件
T淋巴细胞受到PHA作用后发生活化增殖， 其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，四甲 基噻唑蓝（MTT）作为其底物参与反应，被催 化形成蓝紫色结晶甲臢(fomazan) ，经盐酸─异 丙醇或溶解后为蓝色溶液。甲臢的形成量与细胞 增殖活化的程度呈正相关。
ppt课件
31
试剂与器材
1. RPMIl640 培养液 。 2. 植物血凝素（PHA）。
ppt课件
8
试剂与器材
3. 姬姆萨染液。 4. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 5．器材 细胞培养瓶、CO2培养箱、超净台、高
压灭菌器、无菌过滤装置、离心机、显微镜等。
ppt课件
9
操作步骤
外周血0.2ml
PHA
无PHA
5%CO2 37℃ 72h 1500rpm 离心10min
吸取白细胞层涂片ppt课件24 2 ．淋巴细胞转化率的计算：按上述分类检查推片头、体、尾三部 分，分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞和核有丝分裂相细胞以及 成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞， 按下列公式计算转化率：
ppt课件
25
转化率
转化的淋巴细胞数 转化和未转化的淋巴细
胞数
100%
15
四、结果观察
可以见到以下几种类型细胞 (1) 成熟的小淋巴细胞：与未经培养的小淋巴细胞一样为 6 -8
um ，核染色致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱 性。
ppt课件
16
ppt课件
17
淋巴细胞标志及功能检测
龚道科
2002.4
(2) 淋巴母细胞：
细胞体积增大，约 20 - 30 um ，形态不整齐，常有小突出，核 质染色疏松，有核仁 l - 2 个，胞浆变宽，常出现胞浆空泡。
mtt试验原理
mtt试验原理MTT试验原理MTT试验是一种常用的细胞毒性测试方法，被广泛应用于药物筛选、毒性评估、细胞生物学研究等领域。
本文将介绍MTT试验的原理及其在科学研究中的应用。
MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）试验是一种通过测量细胞线粒体脱氢酶活性来评估细胞代谢活性的方法。
MTT试剂会在细胞内还原为可溶性的紫色产物，通过比色法测定其吸光度，可以间接反映细胞的存活水平。
MTT试验的原理如下：首先，将需要测试的细胞接种在培养基中，使其在恰当的条件下生长繁殖。
然后，将待测物添加到细胞培养物中，不同浓度的待测物可以评估其对细胞的毒性作用。
接下来，在特定的时间点，加入MTT试剂到培养物中，允许其在细胞内转化为紫色产物。
最后，通过溶解细胞并测定溶液的吸光度，可以计算出细胞的存活率。
MTT试验的优势在于其简单、快速、经济，并且可以同时测试多个样品。
通过MTT试验，可以评估药物的毒性、筛选抗肿瘤药物、研究细胞增殖和凋亡等生物学过程。
此外，MTT试验还可以与其他实验方法相结合，如细胞周期分析、细胞迁移实验等，从不同角度全面评估细胞的生理状态。
MTT试验的结果常用半数抑制浓度（IC50）来表示药物的毒性。
IC50值是指药物对细胞生长的抑制作用达到50%所需的浓度。
通过比较不同药物的IC50值，可以评估它们的毒性大小，并选择具有较低毒性的药物进行进一步研究。
然而，MTT试验也存在一些局限性。
首先，MTT试验只能反映细胞的存活水平，无法提供关于细胞死亡机制的详细信息。
其次，MTT 试验对于某些药物或化合物可能存在误差，因此需要结合其他实验方法进行验证。
MTT试验是一种简单快速的细胞毒性测试方法，被广泛应用于药物筛选和细胞生物学研究中。
通过测定细胞存活率，可以评估药物的毒性作用，并为进一步研究提供重要参考。
然而，我们也要意识到MTT试验的局限性，并结合其他实验方法进行综合评估。
T淋巴细胞转化实验
试剂与器材
1. RPMIl640 培养液 。 2. 植物血凝素（PHA）。 3. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 4. 器材 超净台、96孔细胞培养板、 CO2培养箱、高压
灭菌器、无菌过滤装置、振荡器、酶联免疫检测仪等。
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操作步骤
分离外周血
100l/孔
单个核细胞1106/ ml
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操作步骤
分离外周血
100l/孔
单个核细胞1106/ ml
培养板 培养板 （含PHA） （无PHA）
5%CO2 37℃ 56h
加入3H-TdR 10l/孔
5%CO2 37℃ 16h
收集培养细胞于滤膜上
液体闪烁器计数cpm
结果判断
以刺激指数(SI)判断淋巴细胞转化程度：
刺激 (S 指 I实 对 ) 数 验 照 c cp p 均 均 m m 组 组 值 本 值 本 c c底 底 p p 值 值 m m
应剂量一般 10m1，培养瓶内液体总量不要超过 2m1 ，太小不足以刺激淋巴细胞转化，试验前应 先测定。
二、MTT比色法
实验目的
熟悉MTT比色法进行淋巴细胞转化试验 的原理及其操作方法。
实一验、原原理 理
T淋巴细胞受到PHA作用后发生活化增殖，其 胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，四甲基 噻唑蓝（MTT）作为其底物参与反应，被催化形成 蓝紫色结晶甲臢(fomazan) ，经盐酸─异丙醇或 溶解后为蓝色溶液。甲臢的形成量与细胞增殖活 化的程度呈正相关。
采取哪些措施可减少实验误差，使结果可信？
三、3H-TdR掺入法
实验目的
熟悉3H-TdR掺入法进行淋巴细胞转化试 验的原理及其操作方法。
MTT法检测淋巴细胞
9.除置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解外， 可用枪头吹打，加快溶解，效果亦可；或放入37度放 孵箱15分钟溶解结晶。 10.至于测定波长的选择是因显色溶液而异的，对于 DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值， 就如ELISA实验选用OPD作底物测定波长是492，选 用TMB显色液则用450）；而对于SDS和酸化异丙醇， 则选用570nm，并且建议以655nm作为参考波长。
现代应用 实验原理
实验步骤
注意事项
细胞筛 选培养
药物药 效实验
现代 应用
药物毒 性检测
基因工 程
实验原理：
1. MTT：化学名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基 四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。 2.检测原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外 源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶（Formazan） 并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜 （DMSO）能溶解细胞中的甲臜结晶 ，用酶联免疫 检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映 活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成 的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物 活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、 细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。 淋巴细胞体外转化代表着细胞免疫功能，因此测定 淋巴细胞体外增殖反应是研究细胞免疫功能的重要 手段和指标。
5. 注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来， 导 致每孔中的细胞数量不等，吹打次数100左右，就可以 吹打均匀了。 6. 吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹 下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。 7. 向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现 细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆， 一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分 散会产生接触抑制，影响细胞的生长。 8. 96孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于 具有一定的温度，使得边缘的孔水分蒸发较快，导致 培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同， 为了减少误差，培养板的四边孔只加培养基或只接种 细胞，而不作为指标检测孔。
MTT法检测番鸭外周血淋巴细胞转化功能的研究
动物医学进展,2005,26(1):75277Progress in Veterinary MedicineMTT法检测番鸭外周血淋巴细胞转化功能的研究林锋强,胡奇林3,陈少莺,陈仕龙,程晓霞,朱小丽(福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350003)中图分类号:S852.4;S858.32文献标识码:A文章编号:100725038(2005)0120075203摘 要:为了建立番鸭淋巴细胞转化检测的MTT法,筛选细胞浓度、刀豆蛋白C onA浓度和培养时间3个参数对试验条件进行了研究。
结果确定了MTT法检测番鸭淋巴细胞转化能力的最佳培养条件,细胞浓度5×106个/ m L在20μg/m L C onA的RMPI1640完全培养基40℃培养60h。
试验表明,该方法可用于番鸭体外细胞免疫功能的检测。
关键词:MTT;番鸭;淋巴细胞转化淋巴细胞转化试验的原理是T淋巴细胞在有丝分裂原(如C onA,PH A)的刺激下,引起细胞内新的DNA合成及细胞分化,从而发生一系列增殖变化,如细胞体积增大、细胞浆增加、核仁明显、染色质疏松等,称为淋巴母细胞。
该试验主要用于体外检测T 淋巴细胞的生物学功能,反映机体的细胞免疫水平[1]。
常用方法有放射性同位素标记法和形态学方法[2]。
放射性同位素标记法需要特殊的仪器设备,较多的人力和物力,并且难以进行大批量的样品检测。
形态学方法主观性强,费时费力[2]。
目前多采用比色法(MTT法)检测淋巴细胞的转化功能,此法操作简便,便于大批量样品检测[3]。
目前,尚未见 收稿日期:2004206230 基金项目:福建省科技厅资助项目(2001Z061) 作者简介:林锋强(1976-),男,福建福州人,助理研究员,硕士,主要从事免疫学和分子生物学研究。
3通讯作者阶段。
最初(1941)是用比较良性的野外毒株给鸡群中的中雏接种,使其自然传播而获得全群免疫,以减少经济损失。
此法接种反应较重,并有长期散毒的危险。
淋巴转化实验报告
一、实验目的1. 了解淋巴细胞转化的基本原理和实验方法。
2. 掌握淋巴细胞转化的检测方法，如MTT法和同位素法。
3. 通过实验了解淋巴细胞转化率与机体免疫水平的关系。
二、实验原理淋巴细胞转化是指淋巴细胞在体外受到有丝分裂原（如PHA、ConA）等刺激后，发生细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白和核酸合成增加等现象，最终转化为淋巴母细胞的过程。
淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的细胞免疫水平。
三、实验材料1. 实验试剂：淋巴细胞分离液、PHA、ConA、MTT、盐酸异丙醇、3H-TdR、肝素钠等。
2. 实验仪器：离心机、酶标测定仪、显微镜、细胞培养箱、移液器等。
3. 实验对象：人外周血淋巴细胞。
四、实验方法1. 淋巴细胞分离（1）采集抗凝血：每个10ml注射器吸入100ul肝素钠抗凝剂（20mg/ml），每个样品无菌采血5-8ml。
（2）分离淋巴细胞：将采集到的抗凝血加入等体积的淋巴细胞分离液，混匀后置于离心机中以2000rpm离心10分钟，弃去上清，即获得淋巴细胞。
2. 淋巴细胞转化实验（1）MTT法：将分离得到的淋巴细胞悬液接种于96孔板，每孔加入PHA或ConA，使细胞浓度为1×10^6/ml。
在细胞培养箱中培养48小时后，加入MTT，继续培养4小时。
然后加入盐酸异丙醇溶解甲臜，用酶标测定仪测定OD值，波长为570nm。
（2）同位素法：将分离得到的淋巴细胞悬液接种于培养瓶，每瓶加入PHA或ConA，使细胞浓度为1×10^6/ml。
在细胞培养箱中培养48小时后，加入3H-TdR，继续培养24小时。
然后收集细胞，用液体闪烁计数仪测定放射性强度。
3. 结果分析根据MTT法和同位素法测定结果，计算淋巴细胞转化率。
淋巴细胞转化率=（实验组OD值或放射性强度-对照组OD值或放射性强度）/对照组OD值或放射性强度×100%。
五、实验结果1. MTT法实验结果：实验组OD值明显高于对照组，说明淋巴细胞在PHA或ConA 的刺激下发生了转化。
小鼠淋巴细胞转化实验报告
小鼠淋巴细胞转化实验报告背景淋巴细胞转化实验是一种常用的实验方法，用于研究免疫系统对外界刺激的反应。
该实验通过刺激小鼠淋巴细胞，观察和分析其增殖和分化情况，以了解免疫细胞对特定抗原的应答能力。
淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，主要负责识别和攻击入侵体内的病原体。
在免疫应答过程中，淋巴细胞会发生转化，即从静止状态进入活跃状态，并开始增殖和分化为具有特定功能的效应细胞。
实验设计本次实验旨在通过刺激小鼠淋巴细胞，观察其在不同条件下的转化情况，并进一步分析其增殖和分化能力。
具体实验设计如下：1.实验组：将小鼠淋巴细胞与特定抗原共培养。
2.阳性对照组：将小鼠淋巴细胞与已知刺激剂共培养。
3.阴性对照组：将小鼠淋巴细胞与无刺激剂共培养。
4.观察时间点：分别在培养开始后的24、48和72小时观察和采样。
实验步骤1.准备工作：消毒实验器具，准备所需培养基和试剂。
2.提取淋巴细胞：通过离心法从小鼠脾脏中提取淋巴细胞。
3.细胞计数和调整浓度：使用显微镜计数室计数细胞数量，并根据实验要求调整细胞浓度。
4.培养实验组、阳性对照组和阴性对照组：将相应的淋巴细胞与特定抗原或刺激剂共培养。
5.培养条件控制：保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度，定期更换培养基。
6.观察和采样：在规定的时间点，观察细胞形态变化，并采集样本用于后续分析。
分析结果细胞形态观察在实验进行的不同时间点，观察到了细胞形态的变化。
刺激后的淋巴细胞在24小时内开始出现细胞体积增大、核浓缩和细胞质深染的特点。
随着时间的推移，细胞数量逐渐增多，并呈现出更多分裂和分化的特征。
细胞增殖分析使用MTT法对不同时间点的培养物进行细胞增殖分析。
结果显示，在实验组和阳性对照组中，细胞增殖率明显高于阴性对照组。
并且，在实验组中，随着时间的延长，细胞增殖率逐渐增加。
细胞表面标记物检测通过流式细胞术检测实验组中转化后淋巴细胞表面标记物的表达情况。
结果显示，在实验组中，与阴性对照组相比，特定抗原诱导了一系列免疫相关标记物的表达上调。
淋巴细胞转化实验报告
一、实验目的本实验旨在了解淋巴细胞转化的基本原理，掌握淋巴细胞转化实验的操作方法，并通过对实验结果的分析，评估机体细胞免疫功能。
二、实验原理淋巴细胞转化是指淋巴细胞在体外受到某些刺激物（如植物血凝素、刀豆蛋白A等）的作用下，发生增殖、分化，转化为淋巴母细胞的过程。
淋巴细胞转化实验是检测细胞免疫功能的重要方法之一。
通过观察淋巴细胞转化率，可以评估机体的细胞免疫功能。
三、实验材料1. 实验动物：小白鼠2. 试剂与耗材：植物血凝素（PHA）、小牛血清、培养液、显微镜、计数板、移液器、离心机等。
四、实验方法1. 采集小白鼠血液，分离淋巴细胞。
2. 将分离得到的淋巴细胞加入含有PHA的培养液中，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养48小时。
3. 培养结束后，收集细胞，用固定液固定细胞，进行染色。
4. 在显微镜下观察淋巴细胞形态变化，计数淋巴母细胞数量。
5. 计算淋巴细胞转化率。
五、实验结果1. 观察到淋巴细胞在培养过程中，部分细胞体积增大，核染色质疏松，核仁明显，胞浆丰富，呈嗜碱性，符合淋巴母细胞特征。
2. 计算淋巴细胞转化率，本实验中淋巴细胞转化率为60.2%。
六、实验讨论1. 淋巴细胞转化实验是检测细胞免疫功能的重要方法，通过观察淋巴细胞转化率，可以评估机体的细胞免疫功能。
2. 本实验中，淋巴细胞转化率为60.2%，说明小白鼠的细胞免疫功能处于正常水平。
3. 实验过程中，应严格控制实验条件，如温度、CO2浓度、培养液成分等，以保证实验结果的准确性。
七、结论本实验通过淋巴细胞转化实验，成功观察到了淋巴细胞在体外培养过程中的转化现象，并计算出淋巴细胞转化率。
结果表明，小白鼠的细胞免疫功能处于正常水平。
八、注意事项1. 实验操作过程中，应严格遵循无菌操作原则，防止污染。
2. 实验过程中，应严格控制实验条件，如温度、CO2浓度、培养液成分等，以保证实验结果的准确性。
3. 实验结果的分析应结合临床实际情况，综合评估机体的免疫功能。
医学免疫学实验：T 淋巴细胞转化试验
T 淋巴细胞转化试验一、实验目的学习并掌握T淋巴细胞转化方法。
二、实验原理T 细胞在体外培养时，受到有丝分裂原（如PHA、ConA）刺激后，可出现细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。
淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的细胞免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。
淋巴细胞转化试验结果的读取可以有形态计数法、MTT 法和同位素法三种。
MTT 法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。
MTT 是一种噻唑盐，化学名3-（4,5-二甲基-2-噻唑）-2,5-二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。
小鼠脾细胞受到ConA（刀豆蛋白A）作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经盐酸-异丙醇溶解后为蓝色溶液，可用酶标测定仪测定细胞培养物的OD值，测定波长570 nm。
根据OD 值的大小计算反应体系中细胞增殖程度。
三、实验材料1. ICR 小鼠（北京大学医学部实验动物中心提供）2. RPMI 1640 培养液，Hank's 液3. 刀豆蛋白A（Concanvalin A, ConA），用RPMI 1640 液配成1 mg / ml，分装小瓶，冷冻保存4. MTT (1mg/ml, 溶于pH 7.2 的PBS 中)5. 2.5%碘酒、75%酒精6. 无菌尖吸管和刻度吸量管7. 无菌解剖器械8. 96 孔平底培养板9. 5% CO2 培养箱（美国NAPCO 公司产品）10. 酶标测定仪（美国BioRad 公司产品）四、实验步骤1. 小鼠脾细胞悬液的制备：取一个灭菌的平皿，加入5 ml Hank's 液。
颈椎脱臼法处死小鼠，取脾脏，放入平皿中，在钢网上研磨并过筛，制成细胞悬液。
取出100 μl用于计数。
将其余细胞悬液移入一离心管中，离心1500 rpm，7 min，（或1000 rpm，10 min）弃去上清，用RPMI 1640 培养液稀释，制成2.5 × 10^6 / ml 的脾细胞悬液，然后加入ConA 使每孔最终浓度为2 μg / ml，同时做不加ConA 的阴性对照孔。
mtt实验方法
mtt实验方法MTT实验方法引言MTT实验方法是一种常用的细胞代谢活性测定方法，通过测定细胞的还原型三甲基四氮唑盐（MTT）的代谢能力来评估细胞的活力和增殖能力。
本文将介绍MTT实验方法的原理、步骤和注意事项。
一、原理MTT（3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide）是一种黄色化合物，能够被细胞内的还原酶还原为紫色的可溶性晶体。
MTT实验利用细胞的代谢活性将MTT还原为紫色产物，通过测量产物的光密度来评估细胞的活力和增殖能力。
二、步骤1. 培养细胞将待测细胞种植在适当的培养基中，并在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养至细胞密度达到要求。
2. 处理样本根据实验需要，给予细胞不同的处理，如药物处理、基因沉默、过表达等。
3. 添加MTT试剂将培养基中的MTT试剂按照一定比例（一般为0.5mg/mL）加入到培养皿中，使细胞与MTT试剂充分接触。
4. 孵育细胞将培养皿放回培养箱中，孵育一定时间（一般为2-4小时），使细胞内的还原酶将MTT还原为可溶性晶体。
5. 溶解晶体将培养皿中的培养基倒掉，加入适量的溶解剂（如DMSO）将晶体溶解，形成紫色液体。
6. 测量光密度将溶解后的液体转移到96孔板中，使用酶标仪或分光光度计测量其光密度（一般在570nm波长下），光密度值越高，代表细胞活力越高。
三、注意事项1. MTT试剂需避光保存，使用前需保持干燥。
2. 实验过程中需严格遵守无菌操作，避免细胞污染。
3. 孵育时间需根据实验需要进行调整，过短的时间可能导致MTT 还原不完全，过长的时间可能导致背景干扰增加。
4. 为减少实验误差，建议设置空白对照组和阴性对照组。
5. 在测量光密度前，需确保晶体完全溶解，否则会出现误差。
结论MTT实验方法是一种简便、可靠的细胞代谢活性测定方法。
通过测量细胞对MTT试剂的还原能力，可以评估细胞的活力和增殖能力。
免疫淋巴细胞转化实验与MTT法
淋巴细胞转化实验与MTT法一、材料1.普通材料：(1)RPMI 1640细胞培养液。
(2)抗生素：青霉素、链霉素、（按100u/ml加入培养液中）。
(3)0.1%植物血凝素(PHA).2.MTT,二甲基亚砜。
3.96孔培养板、酶联免疫检测仪、超净工作台、刻度吸管。
二、实验步骤及方法1.无菌操作，取淋巴细胞分离法分离的淋巴细胞致细胞悬液，调整浓度106个细胞/ml，按100μl/孔加入96孔培养板中，每一份淋巴细胞悬液分6个孔，设置实验组3孔加PHA，阳性对照3孔不加PHA。
↓2.实验组中每孔加含RPMI 1640培养液100μl（含PHA100μg/ml）。
↓3.37。
C,5%CO2 培养箱中培养72h，每日摇动数次。
↓4.培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液100μl，加入100μl不含小牛血清的RPMI 1640培养液，同时加入MTT（5mg/ml）10μl/孔，继续培养4h。
↓5.培养结束后每孔加入200μl的二甲基亚砜，混匀、振荡溶解10min，使紫色结晶完全溶解。
同时设置调零孔RPMI 1640（不含小牛血清培养液100μl，MTT 10μl，二甲基亚,200μl），置酶标仪（主波长570nm，辅助波长630nm）上测OD570。
↓6.计算刺激指数（SI）,SI=实验组OD570均值/阴性对照组OD570均值，以SI的高低来判断淋巴细胞的转化程度。
三、实验注意事项1.选择适当的细胞接种浓度，一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。
但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。
这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。
否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
2.药物浓度的设定，一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。
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一、淋巴细胞转化试验（MTT）（一）原理：四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。
当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。
（二）材料：MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。
用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。
丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原（三）方法：1、脾细胞制备：（1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；（2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；（3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。
放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；（4）制备脾细胞悬液①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min 5-10min， (或1500rpm，4-7min)。
取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。
调整细胞浓度为5 105/ml。
②梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；③酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入400u/ml胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。
注：①一般6～8周龄小鼠，根据品系不同，可得5～20×107细胞/只小鼠；②手术器械灭菌：术前高压灭菌外，也可将手术器械泡在95%酒精的小容器中，使用前取出器械，在酒精灯上烧灼去除酒精，即可保证无菌，此法较为简便。
2、淋巴细胞增殖反应：将5 105/ml脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200ul/孔，每一份脾细胞悬液分装3n个孔，3（n-1）孔加ConA(5ug/mL)，另3个孔不加ConA作为对照。
置5％ CO2，37℃培养48-72h，在培养结束前4-6小时，于培养板各孔内加入5mg/ml MTT液，10ul/孔。
37℃培养4-6小时。
4. 1000g离心10分钟弃上清，各孔内加入150μlDMSO，溶解10min，30分钟内（或加2%SDS 100ul/孔，过夜。
，或干燥后，各孔内加入0.01M盐酸—异丙醇100ul）用酶标测定仪测OD值，测定波长570nm。
实验结果将实验组和对照组三个复孔的OD值平均。
转化值=实验组的平均OD值-对照组的平均OD值。
注意事项（1）由于本实验需要培养3天，才能观察结果。
因此，在操作时应注意无菌操作，避免细菌污染，导致实验的失败。
（2）细胞操作要轻柔、迅速，以免细胞损伤影响实验结果。
二、LAK/TIL细胞的制备与活性测定：淋巴因子激活的细胞毒性细胞（lymphokine activated killer，LAK)和肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)在机体的免疫防御中起着十分重要的作用，特别是在肿瘤免疫过继疗法中具有重要的应用前景，其制备及活性的检测对于评价机体的免疫状态具有重要的意义。
以下主要介绍LAK/TIL制备的常规方法。
(一)主要试剂材料1.试剂①IL-2；②RPMI-1640；③Ⅰ、Ⅳ型胶原酶，DNA酶；④四甲基偶氮盐；⑤酸化异丙醇：含0.04mo1/L HC1的异丙醇；⑥96孔细胞培养板。
2.肿瘤细胞系Raji细胞、Daudi细胞为B细胞性白血病细胞株；Molt-4为T细胞性白血病细胞，对LAK细胞敏感，而对NK细胞毒作用不敏感；K562为红白血病细胞株，对NK细胞毒作用敏感。
所有细胞株均培养在含10%~20% NCS的RPMI-1640完全培养液中，取对数生长期细胞经不完全培养液洗涤，台盼蓝染色计数，以含20% NCS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至2×106/ml备用。
(二)外周血单个核细胞( PBMC )的制备及其LAK细胞的诱导(1)肝素抗凝健康人静脉血通过Ficoll-泛影葡胺密度梯度离心法分离PBMC，用含20% NCS的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至1×106/ml。
(2)将上述细胞加人24孔培养板孔中，同时加人60ug PHA ，rhIL-2，终浓度为500U/ml，将细胞置37℃，5 % CO条件下培养，2~3d换液一次。
吸弃1/22上清，加入含100U/ml的重组人IIr2 20% NCS-RPMI-1640培养液，继续培养3d，收集细胞，即为LAK。
(三)脾细胞的制备及其LAK细胞的体外诱导将通过灌注去除红细胞后的正常人外伤摘除的脾脏，按常规方法制备成单个脾细胞悬液，经离心洗涤后，用含20 % NCS的RPMI-1640完全培养液调整细胞条浓度至1×106/ml，加人rhIL-2，终浓度为500U/ml，将细胞置37℃，5%CO2件下培养，2~3d换液一次。
(四)TIL细胞的分离制备及其诱导(1)无菌切取肿瘤组织，置于含抗生素的RPMI-1640培养液中。
(2)将瘤体机械法剪碎，用RPMI-1640调整体积为10~ 20m1，同时加人0.05%的Ⅰ、Ⅳ型胶原酶、0.001%的透明质酸酶和DNA酶，室温搅拌4~6h。
(3)依次用80目和200目不锈钢网过滤。
(4)经过滤后的细胞悬液以无血清的RPMI-1640洗2次，1 500r/min离心5~l0min。
(5)用含5 % NCS的RPMI-1640完全培养液重悬细胞，将5ml比重为1.077的100%淋巴细胞分层液加人试管底层，其上缓慢加人75%的淋巴细胞分层液(用RPMI-1640配制)，然后缓慢加人上述肿瘤细胞悬液3~5ml。
(6)经1500~1800 r/min离心20min后，分别收集75%和100%淋巴细胞分层液界面层的TIL细胞和其上层的瘤细胞。
(7)用RPMI-1640洗涤2次，每次1500r/min离心5~10min。
肿瘤细胞加人冻存液后液氮冻存备用。
TIL则用含20% NCS的RPMI-1640调整细胞浓度为0.5 ×106/ml。
(8)将上述细胞悬液接种于24孔培养板(1m1/孔)，同时分别加人IL-2 1000U/温箱培养3~4周，其间3~5d更换或IL-2和CD3 McAb lug/m1，置37℃，5%CO2新鲜配制的含IL-2的RPMI-1640完全培养液。
(五)LAK细胞和TIL活性的测定LAK细胞和TIL活性的测定基本同NK活性测定方法。
但所用靶细胞为对NK 不敏感的肿瘤细胞，如Rajf ，Dandi或自体肿瘤细胞。
常采用同位素法如51 Cr 释放试验、发光免疫测定法及MTT，比色法等。
本节介绍MTT比色法。
(1)用含IL-2的20% NCS-RPMI-1640调整LAK细胞或TIL浓度至1.5×106/ml。
(2) LAK细胞或TIL与不同的白血病细胞株按效靶为1：1~20的比例分别取100ul接种于96孔平底培养板内共同培养，每个试验做三个复孔。
设不同浓度效应细胞200ul/孔单独培养，测定效应细胞的吸光度。
同时将不同的白血病细胞株分别用20% NCS-RPMI-1640培养液调整至3 ×104一1×105/ml，取100ul 细胞悬液和100ul培养液接种于96孔培养板中，每个浓度接种3复孔，以测定不同浓度肿瘤细胞的吸光度。
温箱孵育20h，其余步骤同IL-2 (3)将上述接种好的细胞培养板置37℃，CO2生物活性测定。
(4)细胞毒性百分率(%)按下列公式计算ODE + T=效应细胞孔OD值+靶细胞孔OD值ODE=相应浓度单独效应细胞的OD值ODT=相应浓度单独靶细胞的OD三、小鼠造血干细胞/祖细胞免疫磁性分离操作步骤：1) 取小鼠骨髓用BD染色液制成约2×108单细胞悬液2) 阻断：加入Ms Fc BlockTM置冰上15min,0.25mg/106细胞3) 加入Lineage Panel中biotin-mAb, 每种2ml/ 106细胞,冰上15min4) IMag buffer洗涤, 加Streptavidin磁珠, 5ml/ 106细胞, 6-12℃ 30min5) 放入磁场中8min, 将上清小心吸出、收集6) 试管移出磁场, 加buffer重悬阳性片断, 反复吹吸后放入磁场8min7) 小心吸出上清，一并收集8) 重复上两步操作收集的上清中即为通过阴性分离法得到的造血干/祖细胞四、IL-2生物学活性检测（MTT）（一）原理白细胞介素-2（IL-2）是由活化的辅助性T细胞分泌的一种细胞增殖因子，具有促T细胞增殖和维持T细胞体外长期生长的作用。
CTLL-2为IL-2依赖细胞株可用作IL-2生物学活性定量检测。
本实验采用MTT分析法，通过测定CTLL-2细胞的增殖量，确定IL-2生物学活性单位。
检测IL-2的生物学活性，可以间接了解辅助性T细胞的功能。
（二）材料（1）1）10%FCS-RPMI-1640培养液，含2mmol/L谷氨酰胺、25mmol/LHEPES、10U/ml青霉素、100ug/ml链霉素。
（2）MTT（4，5-dimethythiazoyl-zyl2,5-diphenylterrajolium bromiole）用PBSA缓冲液配制成1mg/ml浓度工作液，4℃避光保存。
（3）IL-2标准品。
（4）PHA（200ug/ml）。
（三）方法（1）人外周血T细胞分泌IL-2的诱生：①人PBMC分离：采用常规淋巴细胞分层液浓度梯度离心法分离PBMC，用10%FCS-RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1×105/ml加样：接种细胞悬液于24孔培养板，每孔0.5lml，每孔再加PHA0.5ml，37度，5% CO2孵育48小时。
③回收上清：吸出细胞培养上清，12000r/min离心15分钟，收集上清，-20度冻存。
（2）IL-2生物活性测定①CTLL-2细胞制备：取传代培养24～48小时对数生长期的CTLL-2细胞，用培养液离心洗涤2次，每次1000r/min离心5分钟，再用10%FCS-RPMI-1640培养液调制细胞浓度为1×105/ml。