染色质免疫沉淀(ChIP)实验指南

染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南
ChIP是一项比较流行的研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。

由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。

这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。

当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA 或RNA）之间会产生共价键。

细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。

一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。

在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量－PCR。

但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q－PCR了。

此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。

例如RIP （其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。

第一天：
（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。

（培养基共有9ml）
2、37摄氏度孵育10min。

3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。

450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。

混匀后，在室温下放置5min即可。

4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。

预冷后2000rpm 5min收集细胞。

6、倒去上清。

按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。

使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。

这样每100ul溶液含1×106个细胞。

再加入蛋白酶抑制剂复合物。

假设MCF7长满板为5×106个细胞。

本次细胞长得约为80％。

即为4×106个细胞。

因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。

将2管混在一起，共800ul。

7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。

共14次。

（二）、除杂及抗体哺育。

8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。

去除不溶物质。

留取300ul做实验，其余保存于－80度。

300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul 5M NaCl （NaCl终浓度为0.2M），65度处理4h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。

9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。

再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。

4度颠转混匀1h。

10、1h后，在4度静置10min沉淀，700rpm离心1min。

11、取上清。

各留取20ul做为input。

一管中加入1ul 抗体，另一管中则不加抗体。

4度颠转过夜。

（三）、检验超声破碎的效果。

取100ul超声破碎后产物，加入4ul 5M NaCl，65度处理4h解交联。

分出一半用酚/氯仿抽提。

电泳检测超声效果。

第二天：
（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。

12、孵育过夜后，每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。

4度颠转2h。

13、4度静置10min后，700rpm离心1min。

除去上清。

14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。

清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。

洗涤溶液：a. low salt wash buffer—-one wash
b. high salt wash buffer—–one wash
c. LiCl wash buffer——one wash
d. TE buffer——two wash
15、清洗完毕后，开始洗脱。

洗脱液的配方：100ul 10％SDS，100ul 1M NaHCO3，800ul ddH2O，共1ml。

每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。

重复洗涤一次。

最终的洗脱液为每管500ul。

16、解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。

混匀，65度解交联过夜。

第三天：
（一）、DNA样品的回收
17、解交联结束后，每管加入1ul RNaseA（MBI），37度孵育1h。

18、每管加入10ul 0.5M EDTA，20ul 1M Tris.HCl（PH 6.5），2ul 10mg/ml 蛋白酶K。

45度处理2h。

19、DNA-片段的回收―――omega胶回收试剂盒。

最终的样品溶于100ul ddH2O。

（二）、PCR分析
二、技术总结
（一）、关于细胞
细胞的生长状态要好。

因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。

一般细胞长到75％－80％比较好。

（二）、关于抗体！
抗体是实验成败的致命因素之一！必须是IP级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽量买大厂的抗体。

不推荐国产抗体和santa cruz的抗体，即使是IP级别的。

单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。

两种抗体各有利弊。

单抗特异性强，背景低。

但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。

多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。

一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），选择多抗比较稳妥一些。

（三）、关于交联与超声破碎！
这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。

交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。

交联不充分，只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合，富集得到的Promoter的量不高，实验假阴性。

交联过充分，基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。

另外也会增加背景。

一般来讲，按照我的经验，交联条件取决于细胞类型。

不同的细胞系，交联的条件也不一样。

例如：NIH－3T3的交联条件是室温（25摄氏度）下15min，1％的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。

而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。

当然如果你有bioruptor这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。

一般，理想的超声破碎得到的片段大小是200bp－1000bp。

但是200bp－2000bp的范围也是可以接受的。

（四）、关于操作
希望尽可能的保持低温（4度）。

沉淀的时候可以先在4度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速（500rpm等）离
心使其完全沉降。

虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方，我还是希望你能够连续把它做完，直到PCR结果出来为止。

尽量避免实验中不可预知的影响因素。

（五）、关于解交联
虽然说明书上说4小时已经足够，但是我还是希望你可以解交联过夜。

因为在那样的环境里，DNA不会降解，过夜解交联更充分些。

只是不要忘记在EP管口封上封口膜。

（六）、关于DNA-片段的回收
需要注意的是：样品中SDS样品较高，普通的PCR产物回收试剂盒回收，很有可能会在最终的样品中混入SDS，影响PCR实验结果。

小Tip：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除SDS沉淀。

染色质免疫沉淀（ChIP）实验中应注意的细节问题本文来自互联网搜索，仅供参考使用，最好实验条件需要自己摸索：
1、cell counting：尽量做到准确，会影响input结果。

2、cross link：甲醛的终浓度是1%，这个基本所有的protocol上都会强调。

3、resuspend cells with SDS:一定要选用小的tip头，在液面下吹打，否则很容易产生气泡，后面的sonication就麻烦了。

4、sonication：ChIP中最重要的一部分，合适的条件要自己摸索，可以一次尝试不同次数的sonication，然后建议采用EZ-ChIP上推荐的方法看看sonication的效果如何。

5、加入salmon sperm DNA/Protein A or G之前要先混匀，因为salmon sperm DNA是很粘稠的物质，若不混匀，后面你会发现beads的量不一样，自然也会影响实验的结果。

6、wash 的时候前面几个步骤可以不用洗的太干净，但最后一个要尽量吸干净，必要时可用gel loading tips吸。

7、含beads的samples离心时，有的protocol上推荐是1000rpm，45秒，但可以根据情况调整，但要注意转速不能太快防止beads破碎。

（当然如果采用的是magnetic的beads就不存在这个问题）
8、reverse crosslink可以是65°4个小时，也可以overnight。

9、reverse crosslink后的在进行下面步骤之前建议先离心，把蒸发到离心管盖子上的部分离下来。

10、每次行real time PCR之前都要把sample离心保证取样的准确。

11、1~10ul的枪取3ul以上才比较准确，所以考虑好自己PCR反应体系的配置。