根癌农杆菌Ti质粒的提取和ipt基因的重组与转化

根癌农杆菌Ti质粒的提取和ipt基因的重组与转化

韩烁王佳许鹤煊刘楠李波王宜欣

【实验目的及原理】

本实验是提取根癌农杆菌天然Ti质粒上的ipt基因，并将它转入大肠杆菌中进行表达。ipt 基因位于根癌农杆菌Ti质粒上T-DNA区域，是编码异戊烯基转移酶的基因。此酶是细胞分裂素合成中最重要的限速反应酶。首先设计引物，利用PCR技术以Ti质粒为模板，扩增ipt基因。之后将其与表达载体PET-21连接，转入大肠杆菌中进行诱导表达。SDS-PAGE检测表达蛋白，生物鉴定法检测细胞分裂素活性。

【仪器、材料与试剂】

（一）仪器

1．超净工作台

2．漩涡震荡器

3．低温离心机

4．台式离心机

5．PCR热循环仪

6．超声破碎仪

7．恒温水浴器

8．恒温摇床

9．恒温箱

10．琼脂糖凝胶电泳系统

11．平板电泳槽及配套的玻璃板，胶条，梳子，恒压恒流电泳仪

（二）材料

1．根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens str c58）

2．无水乙醇

3．氯仿

4．琼脂糖

5．TAE电泳缓冲液

6．上样缓冲液及SYBR

7．DNA回收试剂

8．TE溶液

9．PET-21质粒

10．大肠杆菌DH5α

11．L B液体培养基

12．十二烷基硫酸钠（SDS）

13．N aOH

14．T ris碱

15．E DTA

16．N aAc

（三）试剂

1．10%Aps

2．TEMED

3．Acr/Bis(30%)

4．10% (W/V) SDS

5．1.5 mol/l Tris•HCl (PH=8.8)

6．1mol/L IPTG

7．0.1 mol/L CaCl2

8．氨苄（100μg /ml）

9．10×ligase buffer

10．T4 DNA ligase

11．3mol/L KAc（PH5.2）

12．70%乙醇

13．5mmol/L dNTP Mixture

14．10×PCR buffer (含Mg)

15．Taq 酶

16．BamHⅠ, EcoR I

17．MG/L液体培养基

18．1 mg/ml溶菌酶溶液：溶于TE缓冲液

19．LS裂解液：3% SDS ，0.2mol/L NaOH

20．Ts溶液:1mol/L Tris, 4mol/L NaOH (PH 7.0)

21．TES 溶液：50mmol/L Tris, 5mmol/L EDTA, 50mmol/L NaOH (PH 8.0)

22．20× E缓冲液：0.8mol/L Tris, 20mmol/L EDTA, 0.1 mol/L NaAc

23．BCP染料：0.25% 溴甲酚紫，50%甘油， 50mmol/L Tris-乙酸（PH=7.9）

17．考马斯亮蓝染色液

18．脱色液

19．保存液

【实验步骤】

（一）质粒提取

1．取单菌落接种于40mlMG/L液体培养基中，26℃慢摇培养过夜。

2．将2ml菌液取出至于离心管中，室温，5000rpm离心10分钟弃上清。

3．加0.5ml溶菌酶溶液，漩涡混匀，置冰浴中30分钟。

4．加1ml LS裂解液，快速颠倒离心管10次，混合均匀，室温下放置10分钟，得清亮粘稠裂解液。

5．加0.5ml的Ts溶液，快速颠倒离心管10余次，置冰浴中1小时，生成絮状沉淀。

6．于20℃，12000rpm离心15分钟。

7．转移上清至另一离心管中，加2ml冰冷的无水乙醇，混匀后冰上放置30分钟。

8．10000rpm离心10分钟，弃上清。

9．加入0.1ml TES溶液, 轻弹离心管壁，使沉淀溶解。

10．加0.1ml 氯仿，颠倒离心管数次混均，10000rpm离心3分钟（必要时重复氯仿抽提），转移上清至另一离心管中。

11．于上清液中加入2V的无水乙醇，沉淀质粒DNA，于-20ºC保存备用。

（二）PCR扩增及产物回收

1．在0.5ml Eppenddorf 管内配置25μl体系

反应物体积/μl

5mmol/L dNTP Mixture 1

10×PCR buffer (含Mg) 2.5

10pmol/μl 引物1 1

10pmol/μl 引物2 1

模板DNA 1

Taq 酶 1 （1U）

ddH2O 17.5

( 引物1 Sense ：A TTGGA TCCTGGGGAGACGGTAA

引物2 ANTI-Sense：TACATAA TCAAACGTCTTAAGGG )

按以下步骤循环

94℃2’94℃1’45℃1’72℃2’72℃10’

│30 cycles │

2．PCR产物的电泳

配制0.8%琼脂糖凝胶（用电泳缓冲液配制）30ml

TAE电泳缓冲液200ml

产物点样，电泳

3．PCR扩增产物的回收

①切胶，称重

②每100mg胶加入300μl溶胶液，50℃溶胶。

③将在-20℃冻存的玻璃奶解冻，振匀。

④在溶解后的胶液中加入10μl玻璃奶，吹打均匀，冰浴沉淀10分钟。

⑤10000rpm离心1分钟，弃上清。

⑥在离心所得沉淀中加入200稀释液，吹打均匀，10000 rpm离心1分钟，弃上清，如此洗

两次。（稀释液：3体积浓缩液加入7体积无水乙醇）

⑦在超净台中晾干（也可在50℃干燥）

⑧加入20μlTE，吹打均匀，60℃5-10分钟溶解DNA，12，000rpm离心2分钟，收集上

清得回收的DNA，-20℃保存。

(三)重组子的制备

1．按以下成分添加酶切反应体系

管1 管2