微生物限度检查方法验证方案

微生物限度检查方法验证方案

1．概述

药典微生物限度检查法中要求在建立药品的微生物限度检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查。所以对感冒灵颗粒微生物限度检查进行方法的验证。

2．目的

为了保证检验质量，对所用的检验方法必须经过验证，才能确保检验结果的准确可靠。

3．适用范围

本方案适用于感冒灵颗粒微生物方法学的确认与验证。

4．验证人员职责

4.1．验证小组:组长：质量管理部经理

成员：QC主管、微生物操作人员

4.2．职责及分工：QC主管组织起草该验证方案，并组

织实施该方案；

微生物操作人员具体实施该方案；

质量管理部经理协助和监控该方案的实施。

4.3．验证方案批准后，应进行培训。由验证小组指定

人员负责对小组成员及和验证有关的人员进行培训。

5．验证依据

中国药典2015年版通则“1105”、“1106”

6.感冒灵颗粒微生物限度检验方法验证风险分析

6.1 结果分析：通过以上采取的措施，风险均控制在可接受范围内。

7.人员培训确认表

8.验证方法

批号：

感冒灵颗粒规格：批号：

感冒灵颗粒规格：批号：

6.2．验证用培养基：

胰酪大豆胨琼脂培养基生产厂家：

批号：配制批号：

沙氏葡萄糖琼脂培养基生产厂家：批号：配制批号：

营养琼脂培养基生产厂家：批号：配制批号：

胰酪大豆胨液体培养基生产厂家：批号：配制批号：

沙氏葡萄糖琼脂培养基生产厂家：批号：配制批号：

麦康凯液体培养基生产厂家：批号：配制批号：

麦康凯琼脂培养基生产厂家：批号：配制批号：

6.3验证用菌种:

金黄色葡萄球菌（CMCC(B)26 003）、大肠埃希菌（CMCC(B)44 102）、枯草芽孢菌（CMCC(B)63 501）、白色念珠菌（CMCC(F)98 001）、黑曲霉菌（CMCC(F)98 003）

6.4菌液制备：

6.4.4取经30℃~35℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌与枯草芽孢杆菌营养肉汤液体培养物1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－5～10－7为不大于100cfu/ml备用。

6.4.2取经20~25℃培养2~3天的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml，加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－5为不大于100cfu/ml备用。

6.4.3将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20〜25℃培养5〜7天，使大量的孢子成熟。加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH

7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，采用适宜方法吸出孢子悬液无菌试管内用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液依次稀释至，制成每1ml 含孢子数小于100cfu 的孢子悬液。

6.4.4 上述菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2~8℃，可在24内使用。

6.5供试液制备:

取样品10g，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，为1：10供试液。

7.计数方法的验证：

7.1 需氧菌、霉菌及酵母菌计数（平皿法）

所加菌液的体积不得超过供试液体积的1%。为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性检查。

7.2试验组

取上述制备好的供试液，加入试验菌液、混匀，使每1ml 供试液或每张滤膜过滤的供试液中含菌量不大于

100cfu。

7.2.1取的供试液9.9ml和小于10000cfu的铜绿假单胞菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。

7.2.2取的供试液9.9ml和小于10000cfu的金黄色葡萄球菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。

7.2.3取的试液9.9ml和小于10000cfu的枯草芽孢杆菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。7.2.4取的供试液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。7.2.5取的供试液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。平行制备2个平皿。

7.2.6取的供试液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于20～25℃倒置培养5天点计菌落数。平行制备2个平皿。7.2.7取的供试液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌悬液0.1ml混匀后，吸取1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15～20ml，混匀，凝固，于20～25℃倒置培养5天点计菌落数。平行制备2个平皿。

7.3 菌液组

7.3.1取小于100cfu的铜绿假单胞菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml，注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基约15～20ml，混匀，凝固，于30～35℃倒置培养3天点计菌落数。各平行制备2个平皿。

7.3.2取小于100cfu的白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基各

15～20ml，混匀，凝固，于20～25℃倒置培养5天点计菌落数。各平行制备2个平皿。

7.4 供试品对照组

7.4.1取的供试液1ml，注入平皿中，分别立即倾注15～20 ml温度不超过45℃胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，胰酪大豆胨琼脂培养基30～35℃倒置培养3天点计菌落数，

沙氏葡萄糖琼脂培养基20～25℃倒置培养5天点计菌落数。各组平行制备2个平皿。

7.4计算公式：稀释剂对照组的回收率= 稀释剂对照组菌落数-供试品对照组菌数×100%

菌液组菌落数

试验组菌数回收率= 试验组菌落数-供试品对照组菌数×100%

菌液组菌落数

7.5 判定标准：实验组、稀释剂对照组的菌数回收率应在0.5～2之间。若各试验菌的回收率均符合规定，照