基因的体外转录与翻译

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(1)收集细胞：取5×106/ml的培养细胞 20ml，1500rpm离心5min，用新配制的 0.01mol/LPBS洗涤，收集细胞。 (2)低渗液裂解细胞并纯化细胞核：将收
集的细胞迅速加入原体积1/10的低渗缓
冲液[0.01mmol/ L HEPES(4－羟基乙基哌
嗪乙磺酸) pH 7.9,10mmol/LKCl，
(5)核提取物的蛋白定量：核抽提物 总蛋白浓度采用Bradford法测定， 以牛白蛋白为参照。
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附：Bradford法测蛋白含量
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰 法（Bradford法），是根据蛋白质与 染料相结合的原理设计的。这种蛋 白质测定法具有超过其他几种方法 的突出优点，因而正在得到广泛的 应用。这一方法是目前灵敏度最高 的蛋白质测定法。
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（2）仍有一些物质干扰此法的测 定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠 （SDS）和0.1N的NaOH （3）标准曲线也有轻微的非线性， 因而不能用Beer定律进行计算，而 只能用标准曲线来测定未知蛋白质 的浓度。
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细胞核抽提物的制备：
细胞核抽提物：DNA转录由RNA聚合酶、 各种转录因子及必要的环境条件等，这 一切必需由细胞提供。常用于制备细胞 核抽提物的细胞有酵母细胞、兔网织红 细胞和Hela细胞
1、一般方法
优点：细胞核完整、内含物丰富
缺点：在分离的细胞核中可能存 在少量细胞质成分
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Bradford法的突出优点是： （1）灵敏度高，据估计比Lowry法 约高四倍，这是因为蛋白质与染料 结合后产生的颜色变化很大，蛋白 质－染料复合物有更高的消光系数， 因而光吸收值随蛋白质浓度的变化 比Lowry法要大的多。
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（2）测定快速、简便，只需加一种 试剂。完成一个样品的测定，只需 要5分钟左右。由于染料与蛋白质结 合的过程，大约只要2分钟即可完成， 其颜色可以在1小时内保持稳定，且 在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定 性最好。因而完全不用像Lowry法那 样费时和严格地控制时间。
1.5mmol/L MgCl2，20mmol/L KCl，
0.2mmol/L EDTA，0.2mmol/L PMSF，
0.5mmol/L DTT)，冰浴10min，用玻 璃匀浆器匀浆。滴加入2倍核沉淀 体积的高盐缓冲液冰浴 轻轻搅拌
30min。
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(4)收集核提取物：25000g离心 30min，收集上清液后，用缓冲液 透析2h后，4℃，25000g离心20min， 上清液置-70℃保存。
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考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液 中与蛋白质结合，使染料的最大吸收 峰的位置（lmax），由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为 兰色。经研究认为，染料主要是与蛋 白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸） 和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值A595，与 蛋白质浓度成正比。
的转录体系还是原核细胞的转录体
系，基因转录时都必须有启动子序
列，且该序列能被转录体系识别。
原核细胞体外转录体系常用的启动
子有T3、T7及SP6启动子。
真核细胞体外转录体系除需启动子，
增强子等顺式作用元件外，还需各
种反式作用元件的参与。
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Baidu Nhomakorabea 基因体外转录体系
DNA模板：含有转录启动子及必要 的调控序列(起始和终止序列等)的 DNA及为研究基因转录调控的需要, 在体外组装成的核小体链(注意避免 RNase的污染)。
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（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、 Na 、Mg2 离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、 甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测 定法。 此法的缺点是： （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳 香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法 用于不同蛋白质测定时有较大的偏差， 在制作标准曲线时通常选用 g—球蛋白 为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
1.5mmol/L DTT(二硫苏糖醇)，0.2mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氟)]，冰浴30min，用 玻璃匀浆器匀浆，3000rpm离心15min 得细胞核沉淀。
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(3)裂解细胞核：向细胞核沉淀中加
入2倍体积的低盐缓冲液(20mmol/L
HEPES，pH 7.9，25％甘油，
5、染色质结构调整与基因转录的关系；
6、制备RNA探针。
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一、基因体外转录的基本原理
基本原理：以DNA为模板，在无细 胞体系中一系列转录因子的作用下 经RNA聚合酶合成RNA的过程。
质粒DNA
模 板
线性DNA
核小体形式存在的DNA
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能用于体外转录的质粒载体
转录的必要条件：无论是真核细胞
Jakson于1976年创立的，经很多实验室的 不断修订和改进，现已成为一项成熟的分 子生物学和细胞生物学技术，已被多家试 剂公司提供标准的实验程序。
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基因体外转录体系在分子生物学和 细胞生物学研究中的用途和意义：
1、快速检测目的基因的转录情况； 2、分析转录因子调节基因转录的过程； 3、分析启动子序列的活性； 4、分析转录因子、DNA结合蛋白和RNA 剪切因子的组成和作用；
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什么是基因的体外转录和翻译
基因的体外转录和翻译是20世纪70 年代发展起来的一项分子生物学和 细胞生物学实验技术，是研究离体 条件下(非细胞体系)基因表达情况 的理想体系。
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基因表达包括：转录和翻译两个过 程。
基因表达的调控包括：染色体结构 的调节、DNA结构的调节、转录过 程的调控、转录后的调控、翻译过 程的调控及翻译后的调控。
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基因体外转录和翻译的作用：为研 究基因转录和蛋白质翻译提供了一 个十分理想实验体系和技术平台及 找到了一个研究与探讨转录和翻译 这两个复杂的现象的重要手段和方 法。
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第一节 基因的体外转录
• 一、基因体外转录的目的和意义 • 基因的体外转录体系最早由Pelham和