胆红素

(6)氢氧化钠NaOH(1M)，20gNaOH加500ml蒸馏 水，作用是胆红素酯水解成胆红素便于提取。 (7)pH试纸，广泛(1—14)和精密(3.8—5.4，9—14) 试纸。 (8)蒸馏水，用于配置药品。

3 提取方法和操作步骤 (1)用不锈钢医用剪刀剪破胆汁(胆汁要新鲜)，双层 纱布过滤，每100ml新鲜胆汁加入氯仿lml。 (2)将(1)步所得液加热至70℃取下。 (3)加入1MNaOH，调节pH=11～l2，大约每 100ml胆汁加1MNaOH 6ml。 (4)将此液加热煮沸3min，煮时不断搅拌。如有气 泡冒出要吹压几下，以防溢失。

胆红素也可以根据与重氮试剂的不同反应性而 分为两种类型：游离胆红素由于分子中有氢键，与 一种重氮试剂反应缓慢，必须先加入甲醇、乙醇、 尿素、乙酸钠、苯甲酸钠、咖啡因、表面活性剂破 坏氢键后，才能与重氮试剂起明显的颜色反应生成 紫红色的偶氮化合物——偶氮胆红素；而结合胆红 素中由于丙酸基团被取代，胆红素分子不再存在分 子内氢键，因而它可与重氮试剂作用迅速产生红色 偶氮化合物。因此，前者又称为间接胆红素或间接 反应胆红素，后者又称为直接胆红素。

3 讨论 3．1 由于胆红素在溶液中极易被氧，尤其是存在 Fe3+ 、酸及碱的介质中，同时温度越高越易氧化， 时间越长被氧化的量越多。因此，要提高胆红素的 产率，则必须减少氧化。为此，常在溶液中加入 NaHSO3消除氧化剂的影响，加入少量的EDTA以 消除Fe3+ ，制备全过程需时越短越好。在上述三种 方法中，直取法需时最短，2小时即可，而无醇法则 要4—6小时，钙盐法需1—2天。从这个角度说，直 取法最好。
胆红素 提取分离及分析测定实验研究
药学综合性与设计性试验
1关于胆红素 胆红素是红细胞中的血色素所制造的色素，红细胞 有固定的寿命，每日都会有所毁坏。此时，血色素会分 解成为正铁血红素和血红素。然后正铁血红素在酶的作 用下会变成胆红素，而血红素则会重新制成组织蛋白。 是胆汁的主要色素；是动物体内铁卟啉化合物的主要代 谢物，有毒性，可对大脑和神经系统引起不可逆的损害 ，但也有抗氧化功能，可以抑制亚油酸和磷脂的氧化。 是肝功能的重要指标，也是临床上判定黄疸的重要指标 ，
10%HCL (PH=1~2)
粗品处理
4倍CHCL3
萃取蒸馏洗涤
精品
2．1．3 操作步骤 (1)钙盐的制备 取新鲜胆汁，加入4倍体积的石灰水，不断搅拌下加 热至95—97℃ 并保持3分钟，冷却至50℃ 左右后用 细纱布过滤，滤液再加2倍体积的饱和石灰水重复操 作，将沉淀合并，用温热水洗涤一次，干燥后置于 干燥器中保存在阴凉处。 (2)酸化 将钙盐磨细并过80目筛后，放人烧杯中，加入适量 水调成糊状，并加入钙盐量的0.5—1％ 的NaHSO3 ，再用10％HCL酸化，边加盐酸边搅拌边测PH值 ，直至PH=1～2。静置20分钟，倾去酸水，用细纱 布过滤并收集沉淀物。

改变条件
1 ）1:50HCL调PH值 2 ）先用醋酸调PH=5~6，再用1:50HCL调 PH=3~3.5 3 ）先用醋酸调PH=5~6，再用1:50HCL调 PH=3~3.5,在40℃-50 ℃水浴保温15min后热萃取 。

3 含量测定

正常人血清中的胆红素主要分为两种类型：一种是经 过肝细胞内质网作用，与葡糖醛酸或其他物质结合的胆红 素，称为结合胆红素；另一种是主要来自单核吞噬细胞系 统中红细胞破坏产生的胆红素，在血浆中主要与白蛋白结 合而运输，未与葡糖醛酸结合，因此称为游离胆红素或未 结合胆红素。以上两者合称总胆红素。

1.2主要工业来源 目前胆红素的来源是从猪、牛、羊胆中提取。或 医院引流出来的人体胆汁中提取。
1.3用途 胆红素具有抗氧剂以及有效的过氧化氢基清除剂的 功能，保护细胞膜脂质免于这些活性基的氧化作用，是分 析化学和生化研究的重要试剂，也是一种贵重的生化药品， 是人工合成牛黄的主要原料，它配以牛黄胆酸、去氧胆酸、 猪胆酸、胆固醇以及钙、镁、亚铁盐等组成人工牛黄，以 人工牛黄为原料的药品已多达200多种，所以说，胆红素 具有很高的经济价值和医用价值。药理实验证明，它对 W256瘤有较好的抑制作用，对乙型脑炎病毒的灭活率、 抑制指数比去氧胆酸和胆酸高1-1.5倍；它还是一种有效 的肝脏疾病的治疗药物，在不破坏肝组织的情况下，有增 殖新细胞的作用，可治疗血清肝炎、肝硬变等病，此外， 胆红素具有镇静、镇惊、解热、降压、促进红血球新生等 作用。
2 制备方法
2．1 钙盐法 2．1．1 试剂 氯仿；95％ 乙醇；无水乙醇；乙醚；饱和石灰水； NaHSO3；10％HCL；1：1HCL／CH3CH2OH 2．1．2 工艺流程 0.5~1%NaHSO3 4倍体积 新鲜胆汁 胆红素钙盐

胆红素粗品
石灰水 0.5~1%NaHSO3 1:1HCL/CH3CH2OH (PH=2~3)

(7)将两次放出的氯仿集中到蒸馏瓶中，接上冷凝管 ，用水浴加热(65℃～70℃ )，蒸出氯仿，至氯仿完 全蒸干为止，加95％CH3CH2OH5ml，敞开瓶口继 续加热8min(80℃)，待有胆红素小颗粒析出，取下 冷却，用快速滤纸过滤，用蒸馏水冲洗蒸馏瓶。（ 抽滤时用热蒸馏水和微热乙醇洗涤1-2次） (8)连同滤纸烘干，放入干燥器内，避光保存。

2 .3 直取法 2．3. 1 试剂 4％NaOH溶液、氯仿、1：4盐酸溶液、NaHSO3 2．3．2 工艺流程 胆汁 4％NaOH 混和液氯仿及NaHSO3

PH=11~12
1:4HCL PH=3~4
萃取液
蒸馏
胆红素
2．3．3 操作步骤 取新鲜胆汁于玻璃或磁器中，加热搅拌并测温，当 温度升至60～70 ℃时取下，用4％NaOH调PH=1l ～12，再煮沸3分钟，取下冷至20 ℃左右，加入0． 1％左右NaHSO3(用少量水溶解后加入)，加入25～ 30％ 氯仿，用1：4HCI调PH=3～4，移人分液漏 斗中静置，分层后，收集下层黄棕色溶液，重复萃 取3～4次，将收集溶液按以上两种方法的最后一步 ，可得胆红素产品

3.2 任何生产方法不仅要求有高的产率，而且要求高的 质量，在三种方法中所得精品的纯度钙盐法可90％ 以上 ，而无醇法与直取法仅为70％左右。从这个角度看，钙 盐法较好。 3 .3 任何生产方法除以上两个条件必备之外，还必须有 便于批量生产的条件。这三种方法中，钙盐法适于大批 量生产，后两种方法则仅适于少量试验。 3.4 实验表明，在酸化一步中加酸的速度应适当慢，搅 拌速度应快，且应严格控制酸度。一般地，在钙盐法中 PH=1.5，在无醇法及直取法中PH=3. 5为最佳。因为加 酸过快搅拌过慢，容易使钙盐团结(局部酸度过大所致) ，PH值过高会使胆红素与之形成相应的盐，都会降低产 品产率。

(3)漂洗 将酸化后的沉淀置于烧杯中，加适量95％乙醇，加入(2) 用量)的NaHSO3，再加入一定量1：1的HC1/酒精溶液 ，调PH=2—3，沉降10小时左右，虹吸上清液，再加入 一定量95％乙醇，重复操作2—3次，用细纱布过滤，用 热水洗涤2—3次，即得粗品。 (4)精制 将粗品用4倍量氯仿溶解，用细纱布过滤，沉淀再重复操 作3～4次，将收集的滤液置于蒸馏器中，加入少许 NaHSO3并在水浴上加热浓缩，回收氯仿，快干时加入 4—5倍95％ 乙醇，继续蒸馏至无氯仿味为止。抽滤沉淀 ，并依次用少量的热水、无水乙醇和乙醚洗涤沉淀一次 。于50℃左右迅速烘干，置于干燥器内密封保存。

(2)乙醇CH3CH2OH，又名酒精，在生产中的作用 是改变溶剂相，使胆红素析出结晶，起到纯化作用。 (3)盐酸HCL(1：50)，8ml HCL加400ml蒸馏水， 用于调溶液pH值，冰醋酸CH3COOH(1M)也叫乙酸 ，作用同HCL一样。 (4)亚硫酸氢钠NaHSO3，是一种抗氧化剂，用来防 止胆红素被氧化成胆绿素。 (5)维生素C，又称抗坏血酸，也是一种抗氧化剂，防 止胆红素被氧化成胆绿素。

1.4名称及结构：胆红素别名胆深红、胆红质，是动物胆汁 中的主要色素，为血红蛋白分解代谢后的还原产物，是一 个直链的四吡咯环，通过碳桥(C一CH一或CH2一)相连而 成的复杂有机化合物，属于二烯胆素类，分子简式为： C33H36N4O6，分子量为584.65。
1.5性状：为桔红色或淡红棕色的单斜晶体，干燥固体 较稳定，其氯仿溶液置暗处也较稳定，在碱液中或遇 三价铁离子则极不稳定，很快被氧化成胆绿素(即三次 甲基胆色素，再经还原则成为胆色烷，次甲胆色素等 其它成分，胆绿素可以通过体外化学反应或胆绿素还 原酶还原为胆红素)，在光的作用下可与甘氨酸、丙氨 酸或组氨酸结合。胆红素不溶于水，能溶于苯、氯仿、 二硫化碳及酸，易溶于碱，微溶于乙醇和乙醚，胆红 素的钠盐易溶于水，不溶于氯仿，并且其钙盐、镁盐、 钡盐均不溶于水，520nm波长附近有最大吸收峰。

胆红素偏高的危害： 1）常见有急性黄疸型肝炎，急性黄色肝坏死， 慢性活动性肝炎，肝硬化等。 2）溶血性黄疸。 3）急性黄疸型肝炎、急性肝坏死、慢性活动性 肝炎、肝硬化等。 4）引起肝外疾病，溶血型黄疸、新生儿黄疸、 胆石症、胰头症等。

1.1胆红素的体内来源 体内含卟啉的化合物有血红蛋白、肌红蛋白、 过氧化物酶、过氧化氢酶及细胞色素等。成人每日 约产生25-50mg胆红素，胆红素体内来源主要有： ①80%左右胆红素来源于衰老红细胞中血红蛋白的 分解。②小部分来自造血过程中红细胞的过早破坏 。③非血红蛋白血红素的分解。

(5)用冷水迅速冷却至接近室温，加抗氧剂(维生素c)0.12 ％ ～0.15％(重量比)，然后按每100ml胆汁加NaHSO3 0.2g(加前用少量水溶解)氯仿35ml(混匀)，并用稀盐酸 调pH=4～5，大约每100ml胆汁加1：50稀盐酸60ml， 缓慢加入，边加边搅拌，充分混匀。 (6)将此液倒入分液漏斗，静置10min分层，放出下层氯 仿，在上层黄水中，再加入氯仿20m1(1～2次)，摇动或 搅拌后静置分层，放出下层氯仿。

黄疸
由于红细胞本身的内有缺陷（如某些酶的缺乏或血 红蛋白异常）或红细胞受外源性溶血因素的损害（ 如疟疾、免疫性溶血、蛇毒、苯胺等），造成大量 红细胞破坏，产生大量的未结合胆红素，若超过了 肝细胞的处理能力，则使血液中未结合胆红素增多 ，而出现黄疸。 在一些贫血的病人，由于骨髓红细胞系统增生，骨 髓内无效性红细胞生成增多，这种红细胞多在“原 位”破坏，而未能进入血循环，或是进入血循环后 红细胞生存的时间很短（数小时），而使未结合胆 红素增多。 由于红细胞破坏过多，使未结合胆红素 增多而引起的黄疸，称为溶血性黄疸（hemolytic jaundice）。

2．2 无醇法 2．2．1 试剂 氯仿、饱和石灰水、10％ 醋酸，95％乙醇、无水乙 醇、乙醚、亚硫酸氢钠。 2．2．2 工艺流程 2%NaHSO3 胆汁 4倍体积 胆红素钙盐 混和 液 石灰水 10%HCL

(PH=2~3) 1:3氯仿
萃取液
蒸馏
胆红素产品。
2．2．3操作步骤 (1)钙盐的制备(同钙盐法) (2)酸化 将钙盐研磨，过80目筛，加少量水调成糊状，加入钙盐量 2％的NaHSO3，用10％HAc溶液调PH值至2—3。 (3)萃取 向酸化后的混和液中加1：3体积的氯仿，移人烧瓶中回流 30分钟，再用分液漏斗分出氯仿层，余料用同法萃取3—4 次，将氯仿液合并一起 (4)蒸馏 将萃取液置于蒸馏瓶中蒸馏，快干时加入余液3—5倍量的 95％ 乙醇，继续蒸至无氯仿味为止。过滤、用热水、无水 乙醇及乙醚依次洗涤沉淀一次，于50 ℃左右迅速烘干即得 精品胆红素，置于干燥器内密封保存。

快速提取胆红素的方法
1 原理 利用胆红素不溶于水，而溶于酸、碱和有机溶剂的 性质，采用氯仿把胆红素从胆汁中提取出来。 2 设备 酸度计、蒸馏冷凝装置、水浴锅、布氏漏斗、分析 天平。 3 试剂 (1)三氯甲烷CHCL3，又名氯仿，在生产中的作用是 胆红素在氯仿溶液中形成了四个分子的内氢键结构 ，从而获得了大的稳定性，不宜被氧化。