高效液相色谱法-精品课程

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高效液相色谱与经典液相色谱法比较
高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加， 分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠 重力加料，完成一次分析需时数小时。 高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍 均匀、传质阻力小，因而柱效很高。
高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV—10-9g, 荧光检测器—10-11g。
（1）根据梯度装置所能提供的流路个数分为：二 元梯度、三元梯度等； （2）依据溶液混合的方式分为：高压梯度和低压 梯度。
高压梯度，一般只用于二元梯度。精度很高， 易于自动化控制。但必须使用两台高压输液泵， 仪器价格昂贵，故障率亦相对较高。
低压梯度，只需一台高压输液泵，成本低廉， 使用方便。
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2. 高压输液泵 作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱分离 系统。 要求（1）能耐化学腐蚀；
（2）能在高压下连续工作； （3）输出流量稳定，无脉冲，重复性高； （4）适用于梯度洗脱。 类型（1）恒压泵：输出无脉动，对检测器噪声低。但 流速不够稳定。 （2）恒流泵：泵的内体积小，适于梯度洗脱。
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3.过滤器 在高压输液泵的进口和它的出口与进样
阀之间，应设置过滤器。 4.梯度洗脱装置
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两 种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变 它们之间的比例，从而使流动相的强度、极 性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高 分离效果，缩短分析时间的目的。
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高效液相色谱法的分析流程
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一、高压输液系统 1. 贮液器 作用：提供足够数量的符合要求的流动相以完成分析
任务。 要求（1）必须具有足够的容积；
（2）脱气方便； （3）能耐一定的压力； （4）所用材质对所使用的溶剂都是惰性的。 注意（1）溶剂在放入贮液罐之前，必须经过滤膜过 滤，以除去溶剂中的机械杂质； （2）溶剂在使用前必须脱气。
小而引起的体积排阻
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三、高效液相色谱法的特点 高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和
灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度 高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、 强极性、热稳定性差的化合物，以及生物活性 物质和多种天然产物。
其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱， 容量小，分析生物大分子和无机离子困难来自百度文库流 动相消耗大且有毒性的居多。
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二、液相色谱分离原理及分类 和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两
相，即固定相和流动相组成。 被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。
根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分 配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进 行分离。
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按溶质（样品）在两相分离过程的物理 化学性质（分离机理）的不同，液相色谱可 分为： 分配色谱：—— 分配系数 吸附色谱：—— 吸附力 离子交换色谱：—— 离子交换能力 凝胶色谱（体积排阻色谱）：——分子大
准确，重复性好，如图。
装入样品
进样 采样环
进色谱柱 泵入溶剂 出口
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3.自动进样器 由计算机自动控制定量阀，按预先
编好的样品注射程序进行工作。取样、 进样、复位、管路清洗等，可全部自动 完成。
一次可完成几十个、上百个样品的 分析。
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三、色谱柱 担负分离作用的色谱柱是色谱仪的心脏。
6. 高效液相色谱法
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6.1 概述 6.2 高效液相色谱仪
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一、高效液相色谱法简介 高效液相色谱法起源于经典液相色谱法，它
是现代分析化学中最重要的分离分析方法之一。 直到20世纪60年代后期，才产生了具有现代意义 的高效液相色谱。
高效液相色谱是化学、生物化学与分子生物 学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等 学科领域与专业最为重要的分离分析技术。国际 市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售 市场中占有最大的份额，增长速度最快。
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高效液相色谱与气相色谱法比较
分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化 合物；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化 合物，这类物质占有机物总数的80%。 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性” 气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相
通常要求色谱柱的柱效要高，选择性要好，分 析速度要快。
常用分析柱的柱内径一般在2～5mm，也有用内 径小于1mm的细柱，柱长一般在15～50cm。
用于半制备或制备目的的色谱柱内径一般 在6mm以上。
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色谱柱的维护
使用预柱保护分析柱。 大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2～7.5，尽量 不超过该色谱柱的pH范围。 避免流动相组成及极性的剧烈变化。 流动相使用前必须经脱气和过滤处理。 如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应 在实验完毕后将柱子冲洗干净，并保存于乙腈中。 压力升高是需要更换预柱的信号。
为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。流动相对 分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。
操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
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9.2 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪是实现液相色谱分析的 仪器设备，自1967年问世以来，由于使用了 高压输液泵、全多孔微粒填充柱以及高灵敏 的检测器，实现了对样品的高速、高效和高 灵敏的分离测定。
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四、检测器 1.作用
将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供 检测的信号，以完成定性、定量分析的任务。 2.分类 （1）通用型检测器
如折光指数（示差折光）检测器、电导检测器和 蒸发光散射检测器等。 （2）专用型
二、进样器 进样器是将样品溶液准确送入色谱柱的
装置，要求：密闭性好，死体积小，重复性 好，进样引起色谱分离系统的压力和流量波 动要小。 1.隔膜注射进样：使用微量注射器进样。
装置简单、死体积小。但进样量小且重 现性差。
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2.高压进样阀：目前最常用的为六通阀。 由于进样量可由定量管控制，因此进样