高效液相色谱法-精品课程
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高效液相色谱法 PPT课件
①固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
第五章高效液相色谱法6hppt课件-PPT精品文档
四、检 测 器 高效液相色谱仪中的检测器是三大关键部件 (高压输液泵、色 谱柱、检测器)之一，主要用于检测经色谱柱分离后的组分浓 度的变化，并由记录仪绘出谱图来进行定性、定量分析。一 个理想的液相色谱检测器应具备以下特征：灵敏度高；对所 有的溶质都有快速响应；响应对流动相流量和温度变化都不 敏感；不引起柱外谱带扩展；线性范围宽；适用的范围广。 可惜至今没有一种检测器能完全具备这些特征。 常用的检测器为紫外吸收检测器 (UVD)、折光指数检测器 (RID)、电导检测器(ECD)和荧光检测器(FD)。 在高效液相色谱技术发展中，检测器至今是一个薄弱环节， 它没有相当于气相色谱中使用的热导池检测器和氢火焰离子 化检测器那样的即通用又灵敏的检测器。但近几年出现的蒸 发激光散射检测器(ELSD)有望成为高效液相色谱全新的通用 灵敏的质量检测器。
第四节 高效液相色谱仪简介 高效液相色谱仪可分为分析型和制备型，虽然它们的性能 各异、应用范围不同，但其基本组件是相似的，对分析型商品 仪器可有如下两种组合方式： ①完全紧凑的整体系统。其死体积小，灵敏度高，体现高 效液相色谱仪总体实用的特点。 ②独立部件的组合系统。其灵活性高，可根据不同的分析 目的，组装成不同的联接方式。 现在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很 高，即能控制仪器的操作参数 ( 如溶剂梯度洗脱、流动相流量、 柱温、自动进样、洗脱液收集、检测器功能等 ) ，又能对获得 的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、峰 面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、功能齐全 的分析工具。
（二）柱连接方式 柱接头通过过滤片与色谱柱管连接，在色谱柱管的上 下两端要安装过滤片，过滤片一般用多孔不锈钢烧结 材料。此烧结片上的孔径小于填料颗粒直径，却可让 流动相顺利通过，并可阻挡流动相中的极小固体颗粒， 柱出、入口的连接管的死体积亦 应愈小愈好，一般常用窄孔 (内径0.13mm)的厚壁(1.5— 2.0mm)不锈钢管，以减少柱 外死体积。所用柱接头，联 接螺帽，密封圈及色谱柱接 头皆为不锈钢材料。
《高效液相》课件
蛋白质分离与纯化
蛋白质分离
高效液相色谱技术可以用于蛋白质的分离和纯化，通过不 同的分离模式和固定相选择，实现对蛋白质的快速分离和 纯化。
蛋白质性质分析
通过高效液相色谱技术可以对蛋白质的性质进行分析，如 蛋白质的分子量、等电点等，为蛋白质的结构和功能研究 提供有力支持。
蛋白质相互作用研究
高效液相色谱技术可以用于研究蛋白质之间的相互作用， 如蛋白质与配体、抑制剂等之间的相互作用，有助于深入 了解蛋白质的功能和作用机制。
原理
利用不同物质在固定相和流动相之间 的分配系数差异进行分离，通过检测 器进行检测，收集各个组分，达到分 析样品组分的目的。
发展历程
01
02
03
04
起源
20世纪初，俄国植物学家茨 维特发明了色谱法。
1940年代
气相色谱法（GC）出现，并 逐渐发展成熟。
1960年代
高效液相色谱法（HPLC）开 始发展，并逐渐取代气相色谱
02
高效液相色谱仪
仪器组成
进样器
将样品注入色谱柱，是 色谱仪的重要部件之一
。
色谱柱
用于分离样品中的各组 分，由固定相和流动相
组成。
检测器
检测色谱柱流出的组分 ，并将其转换为电信号
。
数据处理系统
用于采集、处理和显示 检测器输出的信号。
重要部件介绍
01
02
03
色谱柱填料
常用的填料有硅胶、氧化 铝、活性炭等，根据不同 分离需求选择合适的填料 。
《高效液相》ppt课件
目录
• 高效液相色谱法简介 • 高效液相色谱仪 • 高效液相色谱分离技术 • 高效液相色谱在生物医药领域的应用 • 高效液相色谱实验技术 • 高效液相色谱技术前沿与展望
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
《高效液相色谱培训》课件
讲解色谱柱的分类、特点以及如何选择合适的色谱柱。
3 柱温控制及常见问题解决方法
详细介绍柱温控制的重要性以及常见问题的解决方法。
二、方法优化
1
流动相的优化与选择
教授流动相的组成与优化方法，以及选择
色谱条件的优化与调整
2
合适流动相的技巧。
分享优化色谱条件和调整方法，以提高分
离效果和分析效率。
3
常见问题与解决方法示例
样品的制备和处理
详细介绍高效液相色谱实验中样品制备和处理的关键步骤。
谱条件设置与调整
指导合理设置色谱条件和对色谱图进行调整，以获得最佳结果。
岗位操作流程及安全要求
说明高效液相色谱岗位的操作流程和实验室安全要求。
五、实验结果分析
1
峰形参数与定量分析
2
探讨峰形参数在定量分析中的作用以及如
何优化峰形。
3
《高效液相色谱培训》 PPT课件
# 高效液相色谱培训
液相色谱是一种广泛应用于化学和生物分析领域的分离技术。本课程将带您 深入了解高效液相色谱的基础知识、方法优化、常见应用、实验操作以及实 验结果的分析与报告撰写。
一、基础知识
1 高效液相色谱简介
介绍高效液相色谱的基本原理、仪器设备和常见术语。
2 色谱柱类型与选择
提供一些常见问题及相应的解决方法示例， 帮助您更好地处理实际应用中的困难。
三、常见应用
药物分析应用
讨论高效液相色谱在药物分析领域 的应用案例和技术要点。
生物大分子分离及分析应用
介绍高效液相色谱在生物大分子分 离和分析方面的重要应用。
环境监测应用
探讨高效液相色谱在环境监测中的 关键应用和技术趋势。
四、实验操作
3 柱温控制及常见问题解决方法
详细介绍柱温控制的重要性以及常见问题的解决方法。
二、方法优化
1
流动相的优化与选择
教授流动相的组成与优化方法，以及选择
色谱条件的优化与调整
2
合适流动相的技巧。
分享优化色谱条件和调整方法，以提高分
离效果和分析效率。
3
常见问题与解决方法示例
样品的制备和处理
详细介绍高效液相色谱实验中样品制备和处理的关键步骤。
谱条件设置与调整
指导合理设置色谱条件和对色谱图进行调整，以获得最佳结果。
岗位操作流程及安全要求
说明高效液相色谱岗位的操作流程和实验室安全要求。
五、实验结果分析
1
峰形参数与定量分析
2
探讨峰形参数在定量分析中的作用以及如
何优化峰形。
3
《高效液相色谱培训》 PPT课件
# 高效液相色谱培训
液相色谱是一种广泛应用于化学和生物分析领域的分离技术。本课程将带您 深入了解高效液相色谱的基础知识、方法优化、常见应用、实验操作以及实 验结果的分析与报告撰写。
一、基础知识
1 高效液相色谱简介
介绍高效液相色谱的基本原理、仪器设备和常见术语。
2 色谱柱类型与选择
提供一些常见问题及相应的解决方法示例， 帮助您更好地处理实际应用中的困难。
三、常见应用
药物分析应用
讨论高效液相色谱在药物分析领域 的应用案例和技术要点。
生物大分子分离及分析应用
介绍高效液相色谱在生物大分子分 离和分析方面的重要应用。
环境监测应用
探讨高效液相色谱在环境监测中的 关键应用和技术趋势。
四、实验操作
中国药典版高效液相色谱法课件
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3.甲醇和乙睛的截止波长是多少， 应用 意义是什么
甲醇和乙睛的截止波长分别为210nm与 190nm左右，在流动相中，增大甲醇和 乙睛的比例，即增加有机相的比例，能 使出峰面积加快，但同时减少分离度。
中国药典版高效液相色谱法
5
二原理
高效液相色谱法是用高压输液泵将 具有不同极性的单一溶剂或不同比例 的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装 有固定相的色谱柱，经进样阀注入供 试品，由流动相带入柱内，在柱内各 成分被分离后，依次进入检测器，色 谱信号由记录仪或积分仪记录。
中国药典版高效液相色谱法
6
三 1.对仪器的一般要求
中国药典版高效液相色谱法
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（3）加校正因子的主成份自身对照法 （4）不加校正因子的主成份自身对照法
中国药典版高效液相色谱法
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（5）面积归一化法
由于峰面积归一化法测定误差大， 因此本法 只能通常用于粗略考察供試 品中的杂质含量，除另有规定外，一 般不宜用于微量杂质的检查，方法是 测量各杂质峰面积和色谱图上除溶剂 外的总色谱 峰面积，计算各峰面积及 其之和占总峰面积的百分率。
（11）紧固件或连接件泄漏-------------（11） 拧紧或更换紧固件
（12）进样装置部分堵塞----------------（12） 检修进样器并清洗
中国药典版高效液相色谱法
27
现象5：峰重现性差
判断————————————--------------排除方法
（1）注射器针头太长，样品液部分漏掉 ------（1）选用合适的针头
高效液相色谱法
一概述 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代 末70年代初发展起来的一种新型分离分析技 术，随着不断改进与发展，目前已成为应用 极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是 在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的 理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相 和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率 高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更 好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方 面进行比较：
高效液相色谱法培训课件
进样方法
整个定量圈体积进样——为获得好的精密度， 进样量应大于定量圈量的2-5倍以上。由于
层流影响，需要有过量的样品液来取代管
壁上的流动相（见下图）。
Sample
Mobile phase
部分定量圈体积进样——当样品量少时， 采用部分体积进样，进样量由微量注射器 手动控制，要求：
不得超过定量圈体积的1/2量
最高操作温度60 ℃，最佳温度 ﹤40℃。
分离碱性物质，所用流动相pH值应高于被 测物pKa一个单位。
ZORBAX RP-HPLC系列柱的使用条件
柱
pH范围
最高温度
SB C18
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
C8
C3 苯基
腈基
XDB
Extend-C18
90℃ 60℃ 60℃ 60℃ 60℃ 60℃ 60℃
喷雾 蒸发 检测
色谱柱流出物
N2
组分的 气溶胶
溶剂 光 源
泵
pH
酸若性注 。调的意
节，： 不流
可能动 用含相 氨缓必 水冲须 、盐是 醋，挥
发
质 谱 检 测 器
Flu
10%
Ms
1%
other 4%
Conduc 5%
Elec 7%
Refra 8%
DAD 22%
检
测
器
UV-VIS
使
43% 用
统
计
色谱柱
注意！
一旦柱压升高，应停止测定，用水 冲洗数小时或更长时间，待压力下降后 再测定，如果不清楚堵在哪一段，则应 逐级检查，换泵头上滤芯，保护柱等。
柱效低的原因 频繁更换流动相组成——加速柱效降低。
高效液相色谱分析 培训课件
（１）高效液相色谱分析的流程由泵将贮液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。
被测物则由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。
废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器做梯度洗脱。
这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。
（２）高效液相色谱的分离过程同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。
它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
开始样品加在柱头上，假设样品中含有３个组分，Ａ、Ｂ和Ｃ，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。
分配系数小的组分Ａ不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。
分配系数大的组分Ｃ在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。
组分Ｂ的分配系数介于Ａ和Ｃ之间，第二个流出色谱柱。
（２）高效液相色谱的分离过程若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离的目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。
其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。
所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效应。
（３）高效液相色谱的分类①液－固色谱法：液－固色谱法（液－固吸附色谱法）的固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的，液－固色谱法常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同异构体，但不宜用于分离同系物。
高效液相色谱法教学精【全】ppt课件
§1-3 色谱柱的分离效率
一、塔板理论 塔板理论认为: 一根柱子可以分为n
段，每段内组分在两相间迅速达到平衡， 把每一段称为一块理论塔板。
设柱长为L，理论塔板高度为H，则
H=L/Ｎ
Ｎ为理论塔板数。
理论塔板数一N
①色谱峰对称 ： N 16(tR )2
说明：
tW
a. 在给定的操作条件下，N几乎相同
三、高效液相色谱法的特点
高压: 以液体作为流动相，液体流经色谱柱时，
受到阻力较大 必须对流动相施加高压。 一般可达到150～300kg／cm2， 甚至可达700kg／cm2以上。
高速:
分析时间较经典液相色谱少得多（交 换速度快），一个复杂样品的分析仅需几 分钟到几十分钟。
高效:
气相色谱的分离效能很高，高效液相 色谱的柱效则更高（化学键合相），一般 约可达 6000理论塔板／米
②一定色谱条件下，对k’有差异的组
分，则柱效愈高，分离效果愈好。
塔板理论的特点和不足：
(1)当L一定时，N 越大(H 越小)，被测组
分在柱内被分配的次数越多，柱效越 高，所得色谱峰越窄。 (2)柱效不能表示被分离组分的实际分离
效果：如两组分的分配系数K 相同，
无论该色谱柱的柱效多大，都无法 分离。
① 柱效较高，ΔK(分配系数)较大，完全分离。 ② ΔK 不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。 ③ 柱效较低，ΔK 较大，但分离的不好。 ④ ΔK 小，柱效低，分离效果更差。
一．分离度的数学表达式：
Rs
2(tR 2 tR1 ) W2 W1
2(tR 2 tR1 )
1.699 [Y1/ 2(2) Y1/ 2(1) ]
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
安捷伦1260高效液相色谱培训课件
C、一般情况下色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱 可以反冲时，才可以反冲除去柱内杂质，否则反冲会 迅速降低柱效。
D、选择使用适宜的流动相（尤其是PH值），以避免固 定相被破坏。有时候可以在进样器前面连接一预柱， 分析柱是键合硅胶，预柱为硅胶，可是流动相在进入 分析柱之前预先被硅胶饱和，避免分析柱中的硅胶基 质被溶解。
概述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年 代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技 术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极 为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经 典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论， 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏 度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度 高、操作自动化的特点。
•9 •安捷伦1260高效液相色谱培训
E、避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接进入柱内， 需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一 个保护柱，保护柱一般是填有固定相的短柱，保护柱可以 经常更换。 F、经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质 G、保存色谱柱时应将色谱柱中充满乙腈或甲醇，柱接
•4 •安捷伦1260高效液相色谱培训
2、输液泵的使用和维护注意事项 A、防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其他任何杂质 微粒都能磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先 除去流动相中的任何固体微粒； B、流动相不应含有任何腐性物质含有缓冲液的流动相不应 保留在柱内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如 果含有缓冲溶液的流动相在柱内，由于蒸发或泄漏，甚至 由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体。这些晶粒将 损坏密封环和柱塞等。因此，仪器在关机前必须将泵清洗 干净，再换成适合色谱柱保存的和有利于泵维护的溶剂。 C、泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空 泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。 D、输液泵的最高压力不要超过规定的最高压力值，否则会 使高压密封环变形。 E、流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的 稳定。
D、选择使用适宜的流动相（尤其是PH值），以避免固 定相被破坏。有时候可以在进样器前面连接一预柱， 分析柱是键合硅胶，预柱为硅胶，可是流动相在进入 分析柱之前预先被硅胶饱和，避免分析柱中的硅胶基 质被溶解。
概述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年 代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技 术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极 为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经 典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论， 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏 度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度 高、操作自动化的特点。
•9 •安捷伦1260高效液相色谱培训
E、避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接进入柱内， 需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一 个保护柱，保护柱一般是填有固定相的短柱，保护柱可以 经常更换。 F、经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质 G、保存色谱柱时应将色谱柱中充满乙腈或甲醇，柱接
•4 •安捷伦1260高效液相色谱培训
2、输液泵的使用和维护注意事项 A、防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其他任何杂质 微粒都能磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先 除去流动相中的任何固体微粒； B、流动相不应含有任何腐性物质含有缓冲液的流动相不应 保留在柱内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如 果含有缓冲溶液的流动相在柱内，由于蒸发或泄漏，甚至 由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体。这些晶粒将 损坏密封环和柱塞等。因此，仪器在关机前必须将泵清洗 干净，再换成适合色谱柱保存的和有利于泵维护的溶剂。 C、泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空 泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。 D、输液泵的最高压力不要超过规定的最高压力值，否则会 使高压密封环变形。 E、流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的 稳定。
《高效液相色谱法B》课件
1 仪器操作注意事项
正确操作仪器，避免因操作不当导致的误差和故障。
2 常见问题解答
解答在实际操作中经常遇到的问题，提供解决方案和技巧。
建立待测物的标准曲线，根据峰面积与浓度的关系，确定待测物的浓度。
数据处理及结果分析
数据处理方法
常用数据处理方法包括峰面积积 分、数据平滑和峰识别等。
色谱图解析
通过分析色谱图的峰形、保留时 间等参数，获取分析物的相关信 息。
结果解释
根据数据和分析方法，结合样品 特性，解释分析结果。
注意事项与常见问题解答
《高效液相色谱法B》 PPT课件
本课程将为您介绍高效液相色谱法B的概述，包括样品制备、色谱柱的选择与 处理、检测器的选择与操作、高效液相色谱法B的定量分析方法、数据处理及 结果分析，以及注意事项与常见问题解答。
概述
1 原理与应用
高效液相色谱法B是一种常用的分析技术，可用于定性和定量分析各种化合物。
检测器的优化
调整检测器的参数，如波长、 灵敏度等，以获得最佳的检 测效果。
故障排除与维护
常见故障及维护方法，以确 保仪器正常运行和数据准确 性。
高效液相色谱法B的定量分析方法
1
外标法
通过与已知浓度标准品比较，确定待测物的浓度。
面积比较，确定待测物的浓度。
3
标准曲线法
色谱柱的选择与处理
柱选取原则
根据样品分子特性和分析目的， 选择合适的色谱柱类型和尺寸。
柱的处理与保养
正确的柱的使用和保养将延长其 寿命，保证分析结果的准确性与 重复性。
流动相选择
根据柱的亲水性或疏水性，选择 适合的流动相，以实现分离和分 析的最佳效果。
检测器的选择与操作
常见检测器
正确操作仪器，避免因操作不当导致的误差和故障。
2 常见问题解答
解答在实际操作中经常遇到的问题，提供解决方案和技巧。
建立待测物的标准曲线，根据峰面积与浓度的关系，确定待测物的浓度。
数据处理及结果分析
数据处理方法
常用数据处理方法包括峰面积积 分、数据平滑和峰识别等。
色谱图解析
通过分析色谱图的峰形、保留时 间等参数，获取分析物的相关信 息。
结果解释
根据数据和分析方法，结合样品 特性，解释分析结果。
注意事项与常见问题解答
《高效液相色谱法B》 PPT课件
本课程将为您介绍高效液相色谱法B的概述，包括样品制备、色谱柱的选择与 处理、检测器的选择与操作、高效液相色谱法B的定量分析方法、数据处理及 结果分析，以及注意事项与常见问题解答。
概述
1 原理与应用
高效液相色谱法B是一种常用的分析技术，可用于定性和定量分析各种化合物。
检测器的优化
调整检测器的参数，如波长、 灵敏度等，以获得最佳的检 测效果。
故障排除与维护
常见故障及维护方法，以确 保仪器正常运行和数据准确 性。
高效液相色谱法B的定量分析方法
1
外标法
通过与已知浓度标准品比较，确定待测物的浓度。
面积比较，确定待测物的浓度。
3
标准曲线法
色谱柱的选择与处理
柱选取原则
根据样品分子特性和分析目的， 选择合适的色谱柱类型和尺寸。
柱的处理与保养
正确的柱的使用和保养将延长其 寿命，保证分析结果的准确性与 重复性。
流动相选择
根据柱的亲水性或疏水性，选择 适合的流动相，以实现分离和分 析的最佳效果。
检测器的选择与操作
常见检测器
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
高效液相色谱法-精品课程共31页
高效液相色谱法-精品课程
11、获得的成功越大，就越令人高兴 。野心 是使人 勤奋的 原因， 节制使 人枯萎 。 12、不问收获，只问耕耘。如同种树 ，先有 根茎， 再有枝 叶，尔 后花实 ，好好 劳动， 不要想 太多， 那样只 会使人 胆孝懒 惰，因 为不实 践，甚 至不接 触社会 ，难道 你是野 人。(名 言网) 13、不怕，不悔(虽然只有四个字，但 常看常 新。 14、我在心里默默地为每一个人祝福 。我爱 自己， 我用清 洁与节 制来珍 惜我的 身体， 我用智 慧和知 识充实 我的头 脑。 15、这世上的一切都借希望而完成。 农夫不 会播下 一粒玉 米，如 果他不 曾希望 它长成 种籽； 单身汉 不会娶 妻，如 果他不 曾希望 有小孩 ；商人 或手艺 人不会 工作， 如果他 不曾希 望因此 而有收 益。-- 马钉路 德。
谢谢你的阅读
❖ 知识就是财富 ❖ 丰富你的人生
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
11、获得的成功越大，就越令人高兴 。野心 是使人 勤奋的 原因， 节制使 人枯萎 。 12、不问收获，只问耕耘。如同种树 ，先有 根茎， 再有枝 叶，尔 后花实 ，好好 劳动， 不要想 太多， 那样只 会使人 胆孝懒 惰，因 为不实 践，甚 至不接 触社会 ，难道 你是野 人。(名 言网) 13、不怕，不悔(虽然只有四个字，但 常看常 新。 14、我在心里默默地为每一个人祝福 。我爱 自己， 我用清 洁与节 制来珍 惜我的 身体， 我用智 慧和知 识充实 我的头 脑。 15、这世上的一切都借希望而完成。 农夫不 会播下 一粒玉 米，如 果他不 曾希望 它长成 种籽； 单身汉 不会娶 妻，如 果他不 曾希望 有小孩 ；商人 或手艺 人不会 工作， 如果他 不曾希 望因此 而有收 益。-- 马钉路 德。
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71、既然我已经踏上这条道路，那么，任72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
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6. 高效液相色谱法
《仪器分析》精品课程组
《仪器分析》精品课程
6.1 概述 6.2 高效液相色谱仪
《仪器分析》精品课程
一、高效液相色谱法简介 高效液相色谱法起源于经典液相色谱法，它
是现代分析化学中最重要的分离分析方法之一。 直到20世纪60年代后期，才产生了具有现代意义 的高效液相色谱。
高效液相色谱是化学、生物化学与分子生物 学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等 学科领域与专业最为重要的分离分析技术。国际 市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售 市场中占有最大的份额，增长速度最快。
为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。流动相对 分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。
操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
《仪器分析》精品课程
9.2 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪是实现液相色谱分析的 仪器设备，自1967年问世以来，由于使用了 高压输液泵、全多孔微粒填充柱以及高灵敏 的检测器，实现了对样品的高速、高效和高 灵敏的分离测定。
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3.过滤器 在高压输液泵的进口和它的出口与进样
阀之间，应设置过滤器。 4.梯度洗脱装置
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两 种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变 它们之间的比例，从而使流动相的强度、极 性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高 分离效果，缩短分析时间的目的。
《仪器分析》精品课程
准确，重复性好，如图。
装入样品
进样 采样环
进色谱柱 泵入溶剂 出口
《仪器分析》精品课程
3.自动进样器 由计算机自动控制定量阀，按预先
编好的样品注射程序进行工作。取样、 进样、复位、管路清洗等，可全部自动 完成。
一次可完成几十个、上百个样品的 分析。
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三、色谱柱 担负分离作用的色谱柱是色谱仪的心脏。
《仪器分析》精品课程
高效液相色谱法的分析流程
《仪器分析》精品课程
一、高压输液系统 1. 贮液器 作用：提供足够数量的符合要求的流动相以完成分析
任务。 要求（1）必须具有足够的容积；
（2）脱气方便； （3）能耐一定的压力； （4）所用材质对所使用的溶剂都是惰性的。 注意（1）溶剂在放入贮液罐之前，必须经过滤膜过 滤，以除去溶剂中的机械杂质； （2）溶剂在使用前必须脱气。
（1）根据梯度装置所能提供的流路个数分为：二 元梯度、三元梯度等； （2）依据溶液混合的方式分为：高压梯度和低压 梯度。
高压梯度，一般只用于二元梯度。精度很高， 易于自动化控制。但必须使用两台高压输液泵， 仪器价格昂贵，故障率亦相对较高。
低压梯度，只需一台高压输液泵，成本低廉， 使用方便。
《仪器分析》精品课程
《仪器分析》精品课程
高效液相色谱与气相色谱法比较
分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化 合物；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化 合物，这类物质占有机物总数的80%。 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性” 气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相
《仪器分析》精品课程
二、液相色谱分离原理及分类 和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两
相，即固定相和流动相组成。 被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。
根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分 配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进 行分离。
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按溶质（样品）在两相分离过程的物理 化学性质（分离机理）的不同，液相色谱可 分为： 分配色谱：—— 分配系数 吸附色谱：—— 吸附力 离子交换色谱：—— 离子交换能力 凝胶色谱（体积排阻色谱）：——分子大
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2. 高压输液泵 作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱分离 系统。 要求（1）能耐化学腐蚀；
（2）能在高压下连续工作； （3）输出流量稳定，无脉冲，重复性高； （4）适用于梯度洗脱。 类型（1）恒压泵：输出无脉动，对检测器噪声低。但 流速不够稳定。 （2）恒流泵：泵的内体积小，适于梯度洗脱。
二、进样器 进样器是将样品溶液准确送入色谱柱的
装置，要求：密闭性好，死体积小，重复性 好，进样引起色谱分离系统的压力和流量波 动要小。 1.隔膜注射进样：使用微量注射器进样。
装置简单、死体积小。但进样量小且重 现性差。
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2.高压进样阀：目前最常用的为六通阀。 由于进样量可由定量管控制，因此进样
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高效液相色谱与经典液相色谱法比较
高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加， 分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠 重力加料，完成一次分析需时数小时。 高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍 均匀、传质阻力小，因而柱效很高。
高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV—10-9g, 荧光检测器—10-11g。
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四、检测器 1.作用
将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供 检测的信号，以完成定性、定量分析的任务。 2.分类 （1）通用型检测器
如折光指数（示差折光）检测器、电导检测器和 蒸发光散射检测器等。 （2）专用型
通常要求色谱柱的柱效要高，选择性要好，分 析速度要快。
常用分析柱的柱内径一般在2～5mm，也有用内 径小于1mm的细柱，柱长一般在15～50cm。
用于半制备或制备目的的色谱柱内径一般 在6mm以上。
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色谱柱的维护
使用预柱保护分析柱。 大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2～7.5，尽量 不超过该色谱柱的pH范围。 避免流动相组成及极性的剧烈变化。 流动相使用前必须经脱气和过滤处理。 如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应 在实验完毕后将柱子冲洗干净，并保存于乙腈中。 压力升高是需要更换预柱的信号。
小而引起的体积排阻
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三、高效液相色谱法的特点 高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和
灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度 高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、 强极性、热稳定性差的化合物，以及生物活性 物质和多种天然产物。
其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱， 容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流 动相消耗大且有毒性的居多。
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6.1 概述 6.2 高效液相色谱仪
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一、高效液相色谱法简介 高效液相色谱法起源于经典液相色谱法，它
是现代分析化学中最重要的分离分析方法之一。 直到20世纪60年代后期，才产生了具有现代意义 的高效液相色谱。
高效液相色谱是化学、生物化学与分子生物 学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等 学科领域与专业最为重要的分离分析技术。国际 市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售 市场中占有最大的份额，增长速度最快。
为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。流动相对 分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。
操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
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9.2 高效液相色谱仪
高效液相色谱仪是实现液相色谱分析的 仪器设备，自1967年问世以来，由于使用了 高压输液泵、全多孔微粒填充柱以及高灵敏 的检测器，实现了对样品的高速、高效和高 灵敏的分离测定。
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3.过滤器 在高压输液泵的进口和它的出口与进样
阀之间，应设置过滤器。 4.梯度洗脱装置
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两 种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变 它们之间的比例，从而使流动相的强度、极 性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高 分离效果，缩短分析时间的目的。
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准确，重复性好，如图。
装入样品
进样 采样环
进色谱柱 泵入溶剂 出口
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3.自动进样器 由计算机自动控制定量阀，按预先
编好的样品注射程序进行工作。取样、 进样、复位、管路清洗等，可全部自动 完成。
一次可完成几十个、上百个样品的 分析。
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三、色谱柱 担负分离作用的色谱柱是色谱仪的心脏。
《仪器分析》精品课程
高效液相色谱法的分析流程
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一、高压输液系统 1. 贮液器 作用：提供足够数量的符合要求的流动相以完成分析
任务。 要求（1）必须具有足够的容积；
（2）脱气方便； （3）能耐一定的压力； （4）所用材质对所使用的溶剂都是惰性的。 注意（1）溶剂在放入贮液罐之前，必须经过滤膜过 滤，以除去溶剂中的机械杂质； （2）溶剂在使用前必须脱气。
（1）根据梯度装置所能提供的流路个数分为：二 元梯度、三元梯度等； （2）依据溶液混合的方式分为：高压梯度和低压 梯度。
高压梯度，一般只用于二元梯度。精度很高， 易于自动化控制。但必须使用两台高压输液泵， 仪器价格昂贵，故障率亦相对较高。
低压梯度，只需一台高压输液泵，成本低廉， 使用方便。
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高效液相色谱与气相色谱法比较
分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化 合物；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化 合物，这类物质占有机物总数的80%。 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性” 气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相
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二、液相色谱分离原理及分类 和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两
相，即固定相和流动相组成。 被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。
根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分 配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进 行分离。
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按溶质（样品）在两相分离过程的物理 化学性质（分离机理）的不同，液相色谱可 分为： 分配色谱：—— 分配系数 吸附色谱：—— 吸附力 离子交换色谱：—— 离子交换能力 凝胶色谱（体积排阻色谱）：——分子大
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2. 高压输液泵 作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱分离 系统。 要求（1）能耐化学腐蚀；
（2）能在高压下连续工作； （3）输出流量稳定，无脉冲，重复性高； （4）适用于梯度洗脱。 类型（1）恒压泵：输出无脉动，对检测器噪声低。但 流速不够稳定。 （2）恒流泵：泵的内体积小，适于梯度洗脱。
二、进样器 进样器是将样品溶液准确送入色谱柱的
装置，要求：密闭性好，死体积小，重复性 好，进样引起色谱分离系统的压力和流量波 动要小。 1.隔膜注射进样：使用微量注射器进样。
装置简单、死体积小。但进样量小且重 现性差。
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2.高压进样阀：目前最常用的为六通阀。 由于进样量可由定量管控制，因此进样
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高效液相色谱与经典液相色谱法比较
高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加， 分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠 重力加料，完成一次分析需时数小时。 高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍 均匀、传质阻力小，因而柱效很高。
高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV—10-9g, 荧光检测器—10-11g。
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四、检测器 1.作用
将柱流出物中样品组成和含量的变化转化为可供 检测的信号，以完成定性、定量分析的任务。 2.分类 （1）通用型检测器
如折光指数（示差折光）检测器、电导检测器和 蒸发光散射检测器等。 （2）专用型
通常要求色谱柱的柱效要高，选择性要好，分 析速度要快。
常用分析柱的柱内径一般在2～5mm，也有用内 径小于1mm的细柱，柱长一般在15～50cm。
用于半制备或制备目的的色谱柱内径一般 在6mm以上。
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色谱柱的维护
使用预柱保护分析柱。 大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2～7.5，尽量 不超过该色谱柱的pH范围。 避免流动相组成及极性的剧烈变化。 流动相使用前必须经脱气和过滤处理。 如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应 在实验完毕后将柱子冲洗干净，并保存于乙腈中。 压力升高是需要更换预柱的信号。
小而引起的体积排阻
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三、高效液相色谱法的特点 高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和
灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度 高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、 强极性、热稳定性差的化合物，以及生物活性 物质和多种天然产物。
其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱， 容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流 动相消耗大且有毒性的居多。