液相色谱分析方法开发的技巧

液相色谱分析方法开发的技巧
你是否一直头疼于液相实验室或是方法开发问题出现的各种意外状况？或许本文总结的“应该避免做的七件事【DDT（Don't Do That）】”可以帮到你。

以下提到7个DDT并没有特别的先后顺序，但是如果都能避免的话，我相信可以让在实验室的日子少一些鸡飞狗跳，多一些岁月静好。

DDT #1：不要滴定含有有机溶剂的溶液
配制缓冲液和并调节其pH有三种方法：正确的方法，简便的方法和错误的方法。

例如我们打算配1000 mL pH 4.0，浓度为20 mM的醋酸盐缓冲液。

正确的方法根据一些网站或者计算工具的计算结果称量好需要的醋酸和醋酸钠的量，然后使用容量瓶稀释到1000 mL。

或者也可以分别配好20mM的醋酸溶液和醋酸钠溶液，然后混合在一起直到测到的pH是4.0为止。

这两种方法都可以得到大约1000 mL pH 4.0 浓度20 mM的缓冲液。

简便的方法是先配好1000 mL 20mM的醋酸钠溶液，然后使用浓醋酸滴定到pH达到4.0。

这方法会配得比1000 mL稍微多的缓冲液，而且使用了高浓度的醋酸滴定，所以缓冲液浓度不再是20mM。

但是这有关系吗？如果使用反相柱的话，缓冲液的浓度影响并不大，所以得到的谱图基本不会有差别。

但是如果使用离子交换、HILIC、混合模式或是其他的离子作用模式，缓冲液的浓度就有影响了，这时使用上述两种不同方法配出来的缓冲液很可能得到不同的谱图。

所以在这些情况下不管使用哪一种方法配制的缓冲液，都要把配制具体方法记录下来，确保以后的分析人员在重复实验时可以得到相同的分析结果。

错误的方法是将缓冲液与有机溶剂（如甲醇或者乙腈）混合后再进行pH滴定。

要知道当把有机溶剂加入到水溶液中后，pH计会测出与加入有机溶剂前不同的数据，而且实验室的温度对滴定含有有机溶剂的缓冲液影响也大，我就有遇到使用这种方法配出的缓冲液，在夏天开发出来的方法，在冬天就没法重复，就是因为实验室温控不好而导致冬夏温差大，结果冬天和夏天利用这方法配制的缓冲液就有明显的差异。

当我们描述一个液相分析方法的缓冲液成分和pH时，习惯把其中的pH对应缓冲液中的水相部分的pH，而忽略加入有机溶剂后缓冲液的pH的变化。

加入有机溶剂后，pH的值是会改变，但是如果我们每次都是以相同的方法配制的话，每次的改变都应该是相同的。

DDT #1就是提醒我们一定要避免滴定含有有机溶剂的缓冲液。

DDT #2：避免在多个方法上使用同一支柱子
当两个不同的方法需要使用规格和描述完全相同的色谱柱时，避免使用同一支柱子，建议每个方法单独使用一支色谱柱。

或许有人好奇在不同的方法上使用同一支柱子到底有什么不好呢？虽然看上去一柱多用挺方便和经济，但是我们迟早会发现前一个方法中的杂质，辅料或是较晚出峰的分析物很可能会在第二个方法中出现，甚至在使用同一支柱子以不同方法分析同一种分析物时，也可能会有
相同的问题发生。

如果每一个方法都使用其特定的色谱柱，可能会发现每年色谱柱上的花费反而减少。

DDT #2告诉我们尽量在不同的方法上使用专用的柱子。

DDT #3：不要使用旧柱子开发新方法
我们知道色谱柱并不便宜，很多实验室的经费还没充裕到每次开发方法筛选柱子时都可以使用全新的柱子，但是我会建议至少找一支使用比较少的柱子来做筛选。

一旦最后选定一支要作为方法开发的色谱柱时，就应该使用一支全新的色谱柱来继续进行开发，因为我见过太多色谱柱在其他方法上使用很久被改性的情况。

仔细想想，当我们花了好几周时间好不容易把方法开发出来，结果发现使用新柱子后无法重复，那该多么抓狂！DDT #3建议我们不要使用太旧的柱子用于方法开发以避免方法开发后期不必要的方法变更。

DDT #4：不要将用过离子对的色谱柱用于不使用离子对的分析方法上
这一点和上述的第2，3点是有关联的。

疏水性大的离子对试剂，例如长链的磺酸盐类，几乎是不可能从色谱柱中完全洗脱出来的。

有实验证实C18色谱柱在使用十二烷基硫酸盐作为流动相添加剂后，当使用约700倍柱体积的的甲醇：磷酸缓冲盐（20：80）缓冲溶剂冲洗C18色谱柱，结果只冲洗出大概一半的离子对试剂，即使使用100%的甲醇或是异丙醇都无法完全把这种离子对试剂完全洗脱出来。

虽然短链的离子试剂相对比较容易洗脱，但是最好还是假设一旦用了离子对试剂后，一定会有一些残留在色谱柱中。

只要有残留的离子对的存在，色谱柱就被改性了，和新柱子就不一样了。

这一点也提醒上述第2，3 点的重要性。

DDT #4提醒我们安全的操作是不要把用过这些容易残留的离子对试剂的柱子用于任何非离子对方法。

DDT #5：不要假设所有的C18色谱柱都是等同的
在有一段时间，我们假设所有的C18都会得到相类似的分析结果。

事实上USP中有个“L”的分类，根据色谱柱的化学性质的不同来分类不同种类的液相色谱柱。

例如C18固定相键合在硅胶或是其它基质上，不论是有封端或是无封端，都属于L1这一类别。

经验丰富的色谱分析人员都知道这种归类太粗糙，但是对刚接触色谱分析的人员来说可能就没有这个意识。

我们可以来看看图1中的三个谱图的比较：首先比较使用厂家A和厂家B色谱柱的谱图，大部分的分析人员都会同意虽然两者保留时间是有些差异，但是得到的分离结果是类似的；但是厂家C的色谱柱所得到的谱图就和前面两个厂家的色谱柱大不相同，但是这三个厂家的产品都是C18色谱柱。

DDT #5告诉我们当使用的不是特定方法所指定的品牌和型号的柱子时要特别小心结果重现的问题。

图1：比较三家不同厂家的C18柱之间的选择性
DDT #6：不要习惯将新配的缓冲液加到还有剩余的缓冲液瓶中
液相分析中使用的缓冲液，例如醋酸盐或是磷酸盐，都是很容易培养出微生物的环境。

在我们的实验室，我们曾经做过一个实验，将不同的缓冲液放置着，然后监测微生物开始生长所需要的时间，我们的结论是大概两周后就必须注意微生物的产生。

而我们的实验室采取比较保守的步骤，每次配新的缓冲液后就只使用一周。

我知道很多色谱分析人员使用缓冲液可以超过两周以上，但是这也和使用什么缓冲液、配置成什么pH以及实验室的环境都有关系。

但是不论如何的小心保护，微生物最后还是会在缓冲液瓶中生长出来。

如果将新配的缓冲液直接加满到还有剩余旧缓冲液的瓶中，就相当于让已经存在的微生物在原来的缓冲液瓶中继续培养。

这对使用UHPLC特别不利，因为这些超高压色谱柱的筛板只有0.2 μm孔径，这些细菌很容易堵塞筛板。

DDT #6提醒我们要注意不要将新配的缓冲液直接加到旧的缓冲液瓶中，而是将新配的缓冲液放入到另一个干净的缓冲液瓶，以避免污染新配的缓冲液。

DDT #7：不要因小而失大
21世纪最贵的是什么？没错，是人才！从经济的角度，分析实验室中花费中占比最大的就是用于分析人员身上的费用（如果不相信可以问问Boss），但是我们却常常忽略这个事实，从而导致每当我们想要节省经费时却因小而失大。

就以一些实验室经常会非常努力地想延长色谱柱寿命为例，我刚刚看过一个在线色谱讨论组的内容，很多同行的建议会出现在这里。

很多人建议当色谱柱失效时使用强溶剂如二氯甲烷或者蛋白增溶剂（protein solublizers）来清洗色谱柱，但是即使使用这些很特殊的方法来冲洗色谱柱也绝对不可能将色谱柱还原到新柱子的状态，但是在使用能互溶的溶剂清洗柱子以及冲回流动相的过程就需要花费很长的时间，这就需要很大的人工成本，另外还有溶剂等其他成本。

我在"LC
Troubleshooting"专栏中说过很多次，如果一支色谱柱能够得到500-600针的进样，就可以算是完成它的使命了，因为折算下来每次分析的成本里色谱柱占的比例很低。

一个实验室真正该做的是对色谱柱的日常预防性的维护，也就是说在每一批样品做完以后一定要冲洗色谱柱，甚至可以不定期反冲清洗色谱柱，这些之外的其他努力可能就没有太大的意义了。

DDT #7告诉我们的是要好好的计算花在修复一些仪器分析配件和购买新的配件（包括色谱柱）两者之间真正的费用差距（必须包括人工的花费）。