缓冲液的配制

Elisa 相关试剂的配制

1、抗体或免疫球蛋白稀释液0.01mol/L pH7.2PBS

NaH2PO4·2H2O——0.39克；Na2HPO4——1.27克；NaCl——0.85克；NaN3——200 mg；H2O（蒸馏水）至1000ml

2、ELISA洗液及HRP标记抗体稀释液PH7.4，PBST

NaCl——2.0克；KH2PO4——0.2克；Na2HPO4·12H2O——2.9克；KCl——0.2克；NaN3——0.2克；H2O至1000ml 吐温（Tween）20 0.5ml；

4°C保存备用

3、包被液（简称CB）pH9.6

Na2CO3——1.59克；NaHCO3——2.93克；NaN3——0.2克；H2O至1000ml 密封盖好，4°C存放备用

4、ELISA底物液（可溶性底物）

磷酸-柠檬酸缓冲液pH5.0

0.1mol/L柠檬酸（21.014克/100ML）——24.3ml；0.2mol/L Na2 HPO4（28.4克/L)——25.7ml；H2O ——50ml；

4°C存放备用

5、DAB底物液（不溶性底物，组化病理等）0.05mol/L pH7.6 tris-HCL

Tris——6.05克；HCL(36%)——3.15克（约2.7ml浓HCL）；H2O 至1000ml DAB为3´，3´二氧基联苯胺，不溶性底物，呈棕红色

ELISA试剂配制及实验流程

是酶联接免疫吸附剂测定(( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。以双抗体夹心法举例说明。

试剂配制：

(1) 包被缓冲液(PH9.6 +0.2 0.05M碳酸盐缓冲液)： Na2CO3——1.59g ;NaHCO3 ——2.93g ；加蒸馏水至1000ml。（用时稀释成1x，加0.1%BSA）

(2)洗涤缓冲液(PH7.4 0.15M PBST)：0.05%Tween-20——0.5ml；加在PBS缓冲液1000ml 中。PBS缓冲液： KH2PO4——0.2g ；Na2PO4·12H2O——2.9g ；NaCl——8g ；KCl——0.2g；加蒸馏水至1000ml。

(3)封闭缓冲液：牛血清白蛋白(BSA)2%——2g ；（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液100ml。(4）稀释液：牛血清白蛋白 0.1 % ——0.1g ；加PBS 缓冲液100ml。

(5）底物缓冲液（PH5.0）：0.2M Na2HPO4(无水28.4g/L，带12结晶水71.7g/L) 取25.7ml 0.1M 柠檬酸(无水19.2g/L，带1结晶水21.01g/L)取24.3ml；加蒸馏水至100ml。 (或Na2HPO4·12H2O——1.84g ；柠檬酸·H2O ——0.51g 加蒸馏水至100ml)

(6)TMB(四甲基联苯胺)显色液（显蓝色）：TMB(2mg/ml水)——0.05ml；底物缓冲液——0.95ml； 30% H2O2 ——0.001ml ；总体积1ml。

(7) 或配OPD(邻苯二胺)显色液（显黄棕色）（现配避光）：OPD（干粉）——0.004g ；底物缓冲液——10ml ；30% H2O2 ——0.015ml ；总体积——10ml。

(8)终止液(2M H2SO4)：在178.3ml水中，逐滴加入浓硫酸(18M，约98%)21.7ml，边加边摇。操作步骤：

1. 包被：用包被液将抗体（一抗）稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜（或37℃温育2~3小时）。次日，弃去孔内溶

液，用洗涤液冲洗3次，中间振荡。(简称洗涤，下同)。

2. 封闭：加0.3ml封闭液于上述已包被之反应孔中，置37℃温育2小时。然后洗涤3次

3. 加样：加待检样品0.1ml于反应孔中，置37℃温育1~2小时。然后洗涤。(同时做空白孔（不加样品），阴性对照孔（野生型）及阳性对照孔)。

4. 加一抗：各反应孔中加入新稀释的抗体0.1ml。置37℃温育1~2小时。然后洗涤。

5. 加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1ml。37℃温育45分钟~1小时，洗涤5次。

6. 加底物液显色：各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液0.1ml（或OPD显色液），37℃暗处温育5~20分钟，或室温暗处10~40分钟充分变色。

7. 终止反应：各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。（TMB底物蓝色变黄色，OPD底物黄色变棕色）

8.结果判定：白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅，用“+”、“-”号表示测OD值：在ELISA检测仪上，TMB底物法使用450nm测各孔OD值，OPD底物法使用492nm检测。通常大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性(以空白对照孔调零后计算)。

4 间接法

操作步骤：

1.包被：用包被液将样品稀释（梯度稀释，比例自己定） 4℃过夜（或37℃温育2~3小时）。次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次（5至7次），中间振荡。(简称洗涤，下同)。

2. 封闭：加0.3ml封闭液于上述已包被之反应孔中，置37℃温育2小时。然后洗涤。

3. 加一抗：各反应孔中加入新稀释的抗体0.1ml。置37℃温育1~2小时。然后洗涤。

4. 加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体0.1ml。37℃温育45分钟~1小时，洗涤5次。

5. 加底物液显色：各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液0.1ml（或OPD显色液），37℃暗处温育5~20分钟，或室温暗处10~40分钟充分变色。

6.终止反应：各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。（TMB底物蓝色变黄色，OPD底物黄色变棕色）

7. 结果判定：白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅，用“+”、“-”号表示测OD值：在ELISA检测仪上，TMB底物法使用450nm测各孔OD值，OPD底物法使用492nm检测。通常大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性(以空白对照孔调零后计算)。

孕酮

1包被缓冲液，

（1）碳酸盐缓冲液（PH9.6 +0.2 0.05M）

Na2CO3——1.59g；NaHCO3——2.93g；加蒸馏水至1000ml。

（2）tris缓冲液（0.05mol/L）50ml 0.1mol/L（Tris）溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml

各种pH值的Tris缓冲液的配制

所需pH值（25℃）0.1mol/L HCl的体积

7．1 45．7

7．2 44．7

7．3 43．4

7．4 42．0

7．5 40．3