基因重组技术生产胰岛素

3. 转录和翻译偶联、连续进行。
4. 不含内含子，缺乏转录后的加工系统 5. 调控主要在转录水平上 6. mRNA的核糖体结合位点上，含有SD序列 Shine-Dalgarno（SD）sequence:
位于mRNA的起始密码AUG的上游5～10 个碱基处，同核糖体16S rRNA3’末端序列 互补，帮助从起始AUG处开始翻译 。
七、原核细胞表达的缺陷
3、原核细胞中表达的真核蛋白不稳定，容易 被细菌蛋白酶降解。 4 、原核细胞没有转录后加工系统，无法识别 内含子，故原核细胞无法表达没有加工过 的真核基因组。 5 、重组原核细胞在培养过程中产生的毒素难 以排除，污染表达产物，影响产品纯度。
七、利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
1. 胰岛素的结构及其生物合成 2. 人胰岛素的生产方法
TATAAT TATGTT TTAACT GATACT
TATAAT
一致顺序 5’-TTGACA lac 5’-TTTACA trp 5’-TTGACA PL 5’-TTGACA
recA tac I tac II
5’-TTGATA
5’-TTGACA 5’-TTGACA
TATAAT TTTAAT
2. 翻译起始序列对表达效率的影响
1. 细胞质中表达
包涵体（inclusion body）
是存在于细胞质中的一种不溶性蛋 白质聚集折叠而成的晶体结构物。
① 优点
使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降 解、不损害寄主细胞
②缺点
回收的蛋白生物活性差。 例： 在大肠杆菌细胞内表达人生长激素 （human growth hormone, hGH）。
2. 人胰岛素的生产方法
迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：
（3）化学转型法制人胰岛素
猪的胰岛素可从原料丰富的猪胰脏中提取获得，
而且猪胰岛素与人胰岛素只在B链的 C末端有一个氨
基酸的差异，猪的为 Ala ，人的为 Thr ，因此将猪胰
岛素在体外酶促转化为人胰岛素不失为一种选择。
2. 人胰岛素的生产方法
pTR194 pTR210 0.85 0.0012 pTR182 0.0006 pTR190
Cro的表 达水平
载体
4. 转录终止区对表达效率的影响
转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基 因，不必浪费资源和能量、不会干扰正常表达。
5. 载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响
增加载体的拷贝数会增加转录出的 mRNA
3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程 菌的构建
1. 胰岛素的结构及其生物合成
N C
信号肽 C 肽（31）
K R
B 肽
C 肽 信号肽酶
A 肽
R R C
S S
A 肽（21）
N
S S
S
S
B 肽（30）
S S
高尔基体内的特异性肽酶
C S
N S S N
S
C
2. 人胰岛素的生产方法
迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：
解作用。
③ T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。 可把pin增加到载体上。
4. 质粒的拷贝数
增加mRNA数量，
提高核糖体与mRNA的结合速度
（1）强启动子提高转录效率；
（2）使用高拷贝表达载体。
可调控的诱导型复制子
宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制
宿主大量生长后，诱导载体质粒复制， 增加拷贝数
（1）SD序列
翻译起始阶段，与核糖体 16sRNA 的 3’ 端相互
作用，正确定位起始密码子
SD 5’—AGGAGGU——AUG——
UCCUCCA
16S rRNA3’
① SD序列距离AUG的距离影响翻译
② mRNA-rRNA互补区域长短影响基因的翻译
5’-UAAGGAGG-3’ > 5’-AAGGA-3’
翻译起始阶段，与核糖体16sRNA的3’端相互作用， 正确定位起始密码子
SD 5’—AGGAGGU——AUG——
UCCUCCA
16S rRNA3’ SD序列距离AUG的距离影响翻译
3. 转录终止子 在表达载体克隆位点的下游一般设计一 段转录终止子，mRNA转录终止信号。
四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位
迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：
（3）化学转型法制人胰岛素
上述思路的技术路线是：在pH为 6-7的有机相中 使胰蛋白酶催化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔 丁酯的存在下，将猪胰岛素 B链C末端的丙氨酸交换 下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯乙酸脱去 叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化 率为60%，但工艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产 品的价格不菲。
2. 人胰岛素的生产方法
迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：
（4）基因工程法制人胰岛素
1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠 杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基
因工程药物。1987年，Novo公司又推出了利用重
组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。
2. 人胰岛素的生产方法
迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：
（1）直接提取法制人胰岛素
早期人的胰岛素是从人的胰脏中直接分离 纯化的，由于原料供应的限制，其产量远远不 能满足日益增多的糖尿病人的临床需求。
2. 人胰岛素的生产方法
迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：
（2）化学合成法制人胰岛素
根据人胰岛素 A链和B链的序列，由单个氨 基酸从头合成。这条化学全合成的路线从技术 上来说是能够做到的，但其生产成本奇高，从 而也限制了产品的广泛应用。
素每克成本高达100美元以上。 为了进一步降低生产成本，美国 Ely LiLi 公司 随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路 线。
3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 （2）人胰岛素原表达法
tac tac Met Met -Gal -Gal Ap Aprr Met Met B B peptide peptide C C peptide peptide A A peptide peptide ori ori N N 人胰岛素原的 人胰岛素原的cDNA cDNA 重组人胰岛素原 重组人胰岛素原 M M M M C C
5. 宿主菌的选择
表达载体与宿主相互匹配
6. 培养条件优化
（1）培养基
（2）环境因素
（3）诱导时间和剂量
七、原核细胞表达的缺陷
1、缺乏翻译后蛋白质的加工修饰系
统，如糖基化、氨基酸修饰等。
2 、原核表达外源蛋白常以包涵体 形式存在，必须经过变性、复 性处理才能获得有生物活性的 蛋白，并且其表达量非常低。
第一节 外源基因在原核细胞中的表达
用原核生物作宿主 原核或噬菌体启动子 SD序列 MCS 终止子
A dividing E. coli
一、原核生物基因表达的特点
1. 只有一种RNA聚合酶
识别原核细胞的启动子，催化所有的 RNA合成。
2. 以操纵子为单位
很多功能上相关的基因前后相连成串， 由一个共同的控制区进行转录的控制。
（4）基因工程法制人胰岛素
上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外 胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应 答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均 与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免疫原 性、注射吸收迅速等优点，充分展示了基因工程在 生物医药领域中的巨大潜力。
3. 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 （1）A链和B链分别表达法
（1）优化翻译起始区
① 起始密码子ATG ② mRNA-rRNA互补区域长短， SD序列 距离AUG的距离，及碱基种类 ③ 翻译增强子
（2）翻译的终止
① 三个终止密码子，防止核糖体跳跃
② 终止密码子后的核苷酸类型，如UAAU
为大肠杆菌最有效的翻译终止序列。 （3）密码子的选择
① 受体菌中共表达稀有密码子tRNA基因
1. 启动子 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始 mRNA合成的序列。 大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致 顺序（consensus sequence）。
-35 Box 和 -10 Box
5’ TTGACA
17bp
TATAAT 转录起始位点
核糖体结合位点
2. 核糖体结合位点（ RBS）
Shine-Dalgarno（SD） sequence
② 将稀有密码子改为偏爱密码子
3. 提高目的产物稳定性
防止被宿主的酶降解。 （1）表达分泌蛋白
外膜
内膜
周间质 质粒
细胞质 染色体
“外排”：蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。 “分泌”：蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。
（2） 使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解 减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。
① 使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少 宿主菌的蛋白酶合成。 ② 大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶的降
③ SD序列后面的4个碱基
5’-AGGAGGU-3’
？？？？
如果是A（T），翻译效率最高； 如果是G（C），效率只有50%或25%。
Leabharlann Baidu
（2）起始密码AUG
AUG左侧的三个碱基也有影响
-半乳糖苷酶的mRNA中： AUG左侧如果是UAU或CUU时，最 为有效； 是UUC、UCA或AGG时下降20倍。 AUG右侧的三个碱基也有影响。
二、原核表达系统的注意事项
1. 外源基因不能带有内含子
为何？
2. 一般用cDNA，不能直接用真核基因组DNA
3. 必须利用原核细胞的强启动子和 SD序列等调 控元件控制外源基因的表达 4. 利用宿主细胞的调控系统，调节外源基因的 表达，防止外源基因的表达对宿主菌的毒害
三、原核生物基因表达的调控
大肠杆菌基因表达载体基本结构特征
化学合成:
A、B链的编 码序列 Ap Aprr
tac tac Met Met -Gal -Gal Met Met A A peptide ori ori peptide Ap Aprr B B peptide ori ori peptide tac tac Met Met -Gal -Gal Met Met
M M N N
M M C C N N
M M
M M C C
（1）A链和B链分别表达法
表达产物的后处理路线：
-Gal -Gal M M N N A A M M C C N N CNBr CNBr 处理 处理 N N C C N N C C N N C C N N C C -Gal -Gal M M M M C C B B
数目，增加表达效率。
但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长
6. 外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率 的影响
六、提高表达水平常用的方法 1. 转录水平的优化
（1）使用强启动子或诱导型启动子
（2）强终止子，或将两个终止子串联
（3）提高mRNA的稳定性
如：在外源基因的下游插入“重复性基
因外回文序列
2. 翻译水平的优化
第七章 克隆基因的表达
克隆基因的表达： 外源基因在宿主细胞中表达 外源基因 表达载体 导入宿主细胞
重组载体 提取蛋白
在宿主细胞中 表达出蛋白质
宿主细胞： 原核细胞或真核细胞。
常见表达系统的类型
原核生物基因 表达系统
大肠杆菌表达系统 芽孢杆菌表达系统 链霉菌表达系统
真核生物基因 表达系统
酵母表达系统 丝状真菌表达系统 昆虫表达系统 哺乳动物细胞表达系统 植物生物反应器
2. 周质中表达
周质（periplasm）
革兰氏阴性菌位于内膜和外膜之间的 细胞结构部分。 优点： 容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、 被降解的少。
3. 胞外表达
使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白 分泌到细胞外的培养基中。 用溶血素基因构建分泌性融合蛋白
或与细菌素释放蛋白共表达
由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分 泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太 理想。
分离纯化 分离纯化
S S S S N N S S S S N N
Cys Cys 体外氧化和重折叠 体外氧化和重折叠
C C S S S S C C
（1）A链和B链分别表达法
生产技术的评价：
由于 A 链和 B 链上共存在六个半胱氨酸残基，
体外二硫键的正确配对率较低，通常只有 10% -
20% ，因此采用这条工艺路线生产的重组人胰岛
五、影响外源基因表达效率的因素 1. 启动子的结构对表达效率的影响 （1）一致顺序
-35 Box 和 -10 Box
5’ TTGACA
17bp
TATAAT 转录起始位点
核糖体结合位点
（2）-35区与-10区之间的距离 间隔为17bp时，启动子最强。 （3）-35区和-10区的碱基顺序 越接近一致顺序，启动子越强。 -35box -10box
3. 启动子与外源基因之间的距离
BamH I lac P S-D lac
1.63 0.085 1.00 0.65 0.54 pTR213 pTR199 pTR214 pTR188
ATG cro ATG cro ATG cro ATG cro ATG cro ATG cro ATG cro ATG cro ATG cro S-D距ATG的距离