第3章细胞生物学实验方法

厚标本和薄标本
4 - 5 um 2um
基础知识
（二）荧光显微镜 Fluorescence microscope
荧光显微镜是以紫外线为 光源，照射被检物体发出 荧光，在显微镜下观察形 状及所在位置，研究某些
物质在细胞内的变化。
还可进行免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。
图像清晰，色彩逼真。 Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green 微管呈绿色、微丝红色、核蓝色
Chapter 3. Techniques in Cell Biology
从整个生命科学的发展趋势看细胞 生物学方法
• 分子水平 细胞水平
• 结构功能
• 分析
细胞生命活动
综合
Main point
• 第一节 显微技术
• 一、光学显微镜
• 二、电子显微镜 • 三、显微操作技术 • 第二节 细胞分离技术 • 第三节 生物化学与分子生物学技术
光学显微镜下无法看清的结构，
又称亚显微结构 (submicroscopic structures）。
TRANSMISSION ELECTRON MICROSCOPE，TEM 透射电子显微镜
2、电子显微镜用到的一些技术 1）制样技术
（1）超薄切片 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅 50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制
环氧树脂超薄切片for TEM的厚度 : 40-50nm
Sections of LM: >5um; Sections of TEM: <100nm
Figure 3-20. Electron micrograph of a root-tip cell stained with osmium and other heavy metal ions. The cell wall, nucleus, vacuoles,
戊二醛的两个醛基可与许多分子共价结合； 锇酸能被许多有机化合 物还原并与之形成共价化合物，因锇酸能与脂肪酸中的C=C双键反应， 因此它在固定细胞膜时非常有用。
Specimen Preparation for Electron Microscopy
Thin Sectioning for TEM
石蜡切片的厚度: 3-10um;
作。
通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂
包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、
铅）盐染色。
a. Specimen Preparation for Electron Microscopy Chemical fixation
戊二醛
锇酸
Figure 3-18. 电子显微镜常用的固定剂
Negative Stained Actin
（3）冷冻断裂技术
先将生物样品在液氮中（－196℃）进行快速 冷冻，防止形成冰晶。然后将冷冻的样品迅速转 移到冷冻装置中，并迅速抽成真空。在真空条件 下，用冰刀横切冷冻样品，使样品的内层被分开 露出两个表面。
（4）冰冻蚀刻复形 freeze-etching
（七）倒置显微镜 inverse microscope
• 物镜与照明系统颠倒，
物镜在载物台之下，照
明系统在载物台之上，
用于观察培养的活细胞
当代显微镜的发展趋势
• 采用组合方式，
集普通光镜加相 差、荧光、暗视 野 、 DIC 、 摄 影 装置于一体。 • 自动化与电子化。
二、电子显微镜
（一）透射电子显微镜 （二）扫描电子显微镜
Figure 3-2. Interference between light waves. When two light waves combine in phase, the amplitude of the resultant wave is larger and the brightness is increased. Two light waves that are out of phase partially cancel each other and produce a wave whose amplitude, and therefore brightness, is decreased.
每一个亮点是晶体 中每个金原子的像， 两个亮点之间的距 离约是0.2 nm (2 Å)， 放大倍数可达百万
倍。
薄层金片的电子显微照片
（一）透射电子显微镜
2.透射电镜的结构：电子照明系统、
电磁透镜成像系统、真空系统、 记录系统、电源系统。 3.用途：用于观察超微结构 (ultrastructure)，即小于0.2µ m、
心光锥，焦聚到标本上。
使用时，环状光阑的中心与物 镜光轴要完全在一直线上
（四）暗视野显微镜 dark field microscope
Figure 3-3. Edge effects. The interference effects observed at high magnification when light passes the edges of a solid object placed between the light source and the observer.
（二）荧光显微镜 Fluorescence microscope
特点： 1.照明方式通常为落射式。 2.光源为紫外线，波长较短，分 辨力高于普通显微镜； 3.有两个特殊的滤光片；
2 l
荧光素
罗丹明
Figure 3-8. Fluorescent dyes. The structures of fluorescein and tetramethylrhodamine, two dyes that are commonly used for fluorescence microscopy. Fluorescein emits green light, whereas the rhodamine dye emits red light.
（四）暗视野显微镜 dark field microscope
结构特点：聚光镜中央有挡光片， 照明光线不直接进人物镜，倾 斜地照射在观察的标本上，标
本遇光发生反射或散射，散射
光进入物镜，因而视野的背景 是黑的，物体的边缘是亮的。 可观察 4~200nm的微粒子，分辨 率比普通显微镜高50倍。
（五）微分干涉差显微镜 Differential interference contrast microscope （DIC）
（三）相差显微镜
A+/B+
相差显微镜的基本原理：把透过标本的可见光的光程差 变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结 构变得清晰可见。
与普通光学显微镜相比有两个特殊之处：
1. 相位板 2. 环形光阑（annular
diaphragm） 位于光源
与聚光器之间，作用是使 透过聚光器的光线形成空
1.原理
次级电子
电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常 50~120KV)的平方根成反比。
表二、不同光线的波长
电子束 名 称 可见光 紫外光 X 射线 α 射线 0.1Kv 波长（nm） 390~760 13~390 0.05~13 0.005~1 0.123 10Kv 0.0122
（一）透射电子显微镜 1. Resolution
检偏器 DIC滑行器 DIC棱镜
偏振器
Figure 3-11. Four types of light microscopy. (A) 普通光学显微镜下看 到的纤维原细胞 (B) phase-contrast microscopy, (C) Nomarski differential-interference-contrast microscopy, and (D) dark-field mic源自文库oscopy.
• 第四节 细胞培养与细胞杂交
第一节
显微技术
• 光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。 • 电子显微镜：以电子束为光源。
—、光学显微镜(The Light Microscopy)
（一）普通光学显微镜
骆驼刺根尖染色体 对二氯苯饱和溶液处理
（一）普通光学显微镜 1. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。
mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, and ribosomes are easily seen.
（2）负染技术
• 用重金属盐(如磷钨 酸)对铺展在载网上 的样品染色；吸去 染料，干燥后，样 品凹陷处铺了一层 重金属盐，而凸的 出地方没有染料沉 积，从而出现负染 效果，分辨力可达 1.5nm左右。
Figure 3-14. Comparison of conventional and confocal fluorescence microscopy. These two micrographs are of the same intact gastrula-stage Drosophila
embryo that has been stained with a fluorescent probe for actin filaments. The conventional, unprocessed image (A) is blurred by the presence of fluorescent structures above and below the plane of focus. In the confocal image (B), this out-offocus information is removed, which results in a crisp optical section of the cell in the embryo.
（六）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM
用激光作光源， 逐点、逐行、逐 面快速扫描； 能显示细胞样品 的立体结构； 用途类似荧光显 微镜，但能扫描 不同层次，形成 立体图像。
LCSM的原理：
共焦小孔 成像透镜 双色镜
物镜
共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。它在某 一瞬间只用一束通过检测器前的小孔的光成像，可显著提 高分辨率。可以观察较厚样品的内部结构。
• 标本置于干冰或液氮中冰
冻。然后断开，升温后，
冰升华，暴露出了断面结 构。向断裂面上喷涂一层 蒸汽碳和铂。然后将组织 溶掉，把碳和铂的膜剥下
来 ， 此 膜 即 为 复 膜
（replica）。
A Yeast Cell
斜喷重金属铂或金
垂直真空喷镀碳， 形成一个连续的碳膜
Figure 3-25. Preparation of a metal-shadowed replica of the surface of a specimen. Note that the thickness of the metal reflects the surface contours of the original specimen.
•思考：如何提高显微镜的分辨能力？
3. Preparation of specimen
Figure 3-5. Making tissue sections. How an embedded tissue is sectioned with a microtome in preparation for examination in the light microscope.
• 1952年，Nomarski发明，利 用两组平面偏振光的干涉， 加强影像的明暗效果，能显 示结构的三维立体投影。标 本可略厚一点，折射率差别
更大，故影像的立体感更强。
DIC显微镜下的硅藻（伪彩色）
（五）微分干涉差显微镜 Differential interference contrast 四个特殊的光学组件： microscope （DIC）
放大率（magnification）:最终成像的大小与原物体大小的比值;
分辨率/力（Resolution）：分辨或区分两质点间最小距离。
（一）普通光学显微镜
2. 构成：
①照明系统 ②光学放大系统
可变光阑
③机械装置
(R)
其中λ为入射光线波长； r=介质折射率； 2θ=镜口角（样品对物镜镜 口的张角)。 rsinθ=镜口率