第3章抗生素发酵生产工艺-2.1

抗生素的化学结构分类
β-内酰胺类抗生素
四环素类抗生素
氨基糖苷类抗生素
大环内脂类抗生素
3.3.1 概述
氨基糖苷类（aminoglycosides）抗生素是由氨 基环醇（aminocyclitol）、氨基糖 （aminosuger）和糖组成的抗生素的总称
均为氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类。 临床应用的氨基糖苷类抗生素：
菌种退化后，菌落变成光秃型或 半光秃型，气生菌丝减少，颜色 改变 。
防止菌种变异，常采取的措施：
①菌种采用冷冻干燥法或砂土管法保存。 ②严格掌握保存生产菌种的条件，所有生产用菌种或斜
面都要保存在冰箱或冷库中（0~4℃），原始斜面的使 用期限不超过5d，生产斜面不超过3d。 ③严格控制生产菌落在琼脂斜面上的传代次数，一般以3 次为限，并采用单菌落传代和新鲜斜面。 ④定期进行纯化筛选，淘汰低单位的退化菌落。 ⑤不断选育出高单位的新菌种，保证稳产高产。
链霉胍衍生物组
2-去氧链霉胺衍生物组
42 5
2-去氧链霉胺
2-去氧链霉胺衍生物组
46
王岳 （1915~1985）
其他氨基环醇衍生物组
有效霉胺类型
春日糖胺类型
氨基酸与氨基糖组成的抗生素类型
福提霉胺类型
3.3.2 链霉素及其理化性质
19S4e4lm年an发A现. W的a第ks一ma个n(氨18基88糖-19苷73类)—抗—生获素1952 年作诺贝用尔靶医点学是和结生合理核学奖糖体30S亚基蛋白质和
16ASlberrRt SNchAa，tz后抑被制追加蛋为白共质同发的现合人成。 对球菌、分枝杆菌、巴氏杆菌、布鲁氏杆
菌、嗜血杆菌等有显著抑制作用，特别用 于治疗结核病，还用于治疗G-所引起的感 染
抗菌机理
抑制蛋白质合成的全过程（起始、延伸、终止）
—— 静止期杀菌药
1. 起始阶段：抑制30S亚基始动复合物和70S亚基始 动复合物的形成；
物理性质
链霉素游离碱为白色粉末。大多数盐类也是白色粉末或结晶，无嗅， 味微苦。
链霉素分子中有三个碱性基团，其中两个是链霉胍上的强碱性胍基 （pK=11.5），第三个是葡萄糖胺上的弱碱性的甲氨基（pK=7.7）。
链霉素在中性溶液中能以三价阳离子形式存在，所以，可用离子交换 法进行提取 。
表 链霉素硫酸盐的溶解度(28℃)
溶剂
溶解度 (mg/ml)
溶剂
水 甲醇 乙醇 异丙醇 异戊醇 环己烷
苯 甲苯
>20 0.85 0.30 0.01 0.30 0.04 0.027 0.03
石油醚 异辛烷 四氯化碳 醋酸乙酯 醋酸异戊酯 丙酮 甲乙基酮
醚
光学性质
溶解度 (mg/ml)
0.015 0.0015 0.035
2’’ 3’’
CHO ★ NH OH
ChemPastCeHr3
CH3
R2
C R3 O O NH2
HO
OH NHCH3
OH
O
NH2
O
CH3
NH2
链霉胍 streptidine
链霉糖 streptose
N-甲基-L-葡萄糖胺 N-methyl-L-glucosamine
链霉双糖胺
stroptobiosamine
★ NH
H2N C NH
★
NH C NH2
CH2OH
HO 3 24
O
O 5’’
O
1’’ 4’’ OH
1’ 2’
NH 1 6 5 OH OH
O 3’
4’
OH CHO
2’’ 3’’
★ NH OH
ChemPastCeHr3
CH3
链霉胍 streptidine
链霉糖 streptose
N-甲基-L-葡萄糖胺 N-methyl-L-glucosamine
旋光性[α]
25 D
-79
-86.1
-7.6
88.5
3.3.3 链霉素的发酵工艺过程
灰色链霉菌（Streptomyces griseus） 菌落形态
灰色链霉菌的孢子柄直而短，不呈螺旋形。 孢子量很多，呈椭圆球形。气生菌丝和孢 子均呈白色。菌落生长丰满，呈梅花形或 馒头形，直径约为3~4mm。基内菌丝透 明，在斜面背后产生淡棕色色 素。
菌 株 转速 (r/min)
600
773号
500
350
130
效价
90.7％ 99.6％ 100％ 3.3％
菌 株 转速 (r/min)
500
973号
350
130
50
效价
61.3％ 100％ 20.7％
9％
(2)温度的影响及控制
链霉素发酵温度以28.5℃左右为宜。
发酵温度 (℃)
25
27
发酵单位 (mg/(L·h))
抗生素后效应（PAE）指细菌与抗生素短暂接触， 当药物浓度下降，低于最低抑菌浓度（MIC）或 清除后，细菌的生长仍受到持续抑制的效应。
它可被看作为病原体接触抗生素后复苏所需要的 时间。
氨基苷类：与细菌核糖体亚基结合，阻碍敏感细 菌蛋白质合成。它们的PAE表示药物从结合部位 解离，细菌恢复核糖体合成蛋白能力所需的时间。
2. 延伸阶段：与30S亚基的P10蛋白结合，致A位歪曲， mRNA错译，阻止移位；
3. 终止阶段：阻止终止密码子与A位结合；阻止70S 亚基的解离。
转录
翻译 蛋白体蛋
白质结合，
起到了干扰
结核杆菌蛋
复制
白质合成的 作用，从而
杀灭或者抑
制结核杆菌
生长的作用。
链霉素的结构
链霉素A：N-甲基-α-L-葡萄糖胺-(1→2)-α-L-链霉糖-(1→4)链霉胍
表 链霉素与双氢链霉素稳定性比较(室温)
抗生素活力 链霉素活力 双氢链霉素活力
0.5mol/L H2S04 (24h) 16％ 25.6％
0.1mol/L NaOH (20h) 0
96.2％
溶解度
链霉素易溶于水，而难溶于有机溶剂中， 链霉素盐酸盐易溶于甲醇，难溶于乙醇， 硫酸盐即使在甲醇中也很难溶解。
2. 无机氮源以硫酸铵和尿素为最常用，氨水可作无机氮源 使用，可又调节发酵pH值。
3. 游离的氨基酸对链霉菌的生长和生物合成有促进作用。
3. 无机元素
1. 磷酸盐抑制链霉素合成的实际浓度与所用的糖的种类有 关，生产上采用葡萄糖和较低浓度的磷酸盐
2. 碳酸钙即可调节pH，又能促进链霉素生成 3. 0.25 % NaCl，1-2 mg/L的Co2+维持菌体渗透压 4. 控制Fe2+浓度在20 ug/ml，60 ug/ml会产生毒性
0.30 0.10 0.O 0.05 0.035
溶剂
二氯乙烷 二氧环己烷
氯仿 二硫化碳
吡啶 甲酰胺 乙二醇 苯甲醇
溶解度 (mg/ml)
0.30 0.60 0.0 0.25 0.135 0.107 0.25 505
链霉素盐(1%水溶液) 链霉素硫酸盐 链霉素盐酸盐 链霉素氯化钙复盐 双氢链霉素硫酸盐
发酵工艺及控制要点
1. 斜面孢子培养 斜面培养基的主要成分有葡萄糖、蛋白胨和豌 豆浸汁。 原始斜面的质量要求：菌落分布均匀，密度适 中，颜色洁白，单菌落丰满。 生产斜面：菌落应为白色丰满的梅花型或馒头 型，背面为淡棕色色素，排除各种杂型菌落。
摇瓶种子培养
27℃，培养基成分包括黄豆饼粉、葡 萄糖、硫酸铵、碳酸钙等。可经过2次扩 大繁殖，再接入种子罐。
游离碱常常具有不同程度的吸收二氧化碳的能力。 该类抗生素的相对分子质量较小，均在300～800
之间。
（二）氨基糖苷类抗生素的分类
氨基环醇／糖
名称
取代数与位置
组别与代表抗生素
1,3一二氨基环醇
链霉胍
一取代
链霉素组：链霉素、双氢链霉素、甘露糖链霉素
去氧链霉胺
4,5一二取代
新霉素组：新霉素B、巴龙霉素、利维霉素(青紫霉素) 核糖霉素组：核糖霉素、丁胺菌素A、丁胺菌素B
H39O12N7·3HCl·1/2CaCl
2
C21H39O12N7 C21 H41O12N7·3/2H2S04
C21 H41O12N7·HCl C21H41O12N7
相对分子质 量
728.7 691 746.5 581.6 730.7 693.0 583.6
理论效价／mg
789 842 780 1000 798 842 1000
10
17.3
(3)pH值的影响及控制
29
21.1
31
5.75
链霉菌菌丝生长的pH值约为6.5～7.0，而链霉素合成 的pH值约为6.8~7.3
(4)中间补料控制
补碳 解除葡萄糖对甘露糖苷酶的分解阻遏作用，调节
异帕卡星、阿贝卡星
【抗菌谱】
对G-杆菌有强大的杀灭作用 １、G-菌
对G-球菌效差 耐药金葡菌：有效 2、 G+菌 链球菌：无效 3、结核杆菌：链霉素、卡那霉素、阿米卡星 4、肠球菌、厌氧菌：无效
（一）抗菌作用及其机制
广谱，对需氧G-菌有强大杀灭作用，对某些G+ 菌亦有杀菌作用，对厌氧菌几乎无抗菌作用。 对静止期细菌的杀菌力较强。在碱性环境中，其 抗菌作用显著增强。 与青霉素或头孢菌素合用，有协同作用。 有抗生素的后续效应（post antibiotic effect)。
4,6一二取代
卡那霉素组；卡那霉素A、卡那霉素B、卡那霉素C、妥布霉素 庆大霉素A组：庆大霉素A、庆大霉素B 庆大霉素C组：庆大霉素Cl～庆大霉素C2 西索霉素组：西索米星、突变霉素
一取代
越霉素、潮霉素A、阿帕拉霉素
大观霉胺
4,5一二取代
大观霉素
1,4一二氨基环醇 1一氨基环醇 1,3一二氨基糖 1,2一二氨基糖
生物制药工程
主讲教师： 刘 凯 liukai_1982@163.com
山东农业大学生命科学学院微生物系
第三章 抗生素发酵生产工艺
3.1 概述 3.2 青霉素的发酵生产工艺 3.3 链霉素的发酵生产工艺 3.4 红霉素的发酵生产工艺 3.5 四环素的发酵生产工艺
内容
3.3.1 氨基糖苷类抗生素的概述 3.3.2 链霉素及其理化性质 3.3.3 链霉素的发酵工艺过程 3.3.4 链霉素的分离纯化工艺过程
链霉素或双氢链霉素的效价标准，系以1μg链霉素碱为1 个单位。由此可以算出链霉素各种盐类的理论效价。
名称
链霉素硫酸盐 链霉素盐酸盐 链霉素氯化钙复盐 链霉素碱 双氢链霉素硫酸盐 双氢链霉素盐酸盐 双氢链霉素碱
化学式
C21 H39O12N7·3/2H2S04 C21H39O12N7·3HCl C21
福提霉胺 有效霉胺 春日糖胺 D-古洛糖胺
一取代 1,4-二取代 一取代 1,2一二取代
阿司米星 有效霉素 春日糖素 链丝菌素A～F
H2N C NH
★
★ NH
NH C NH2
HO 2 3 4 O
1’ 2’
O
CH2OH O 5’’
R1HN
1’’ 4’’ OH
NH 1 6 5 OH OH
O 3’
4’
OH
链霉素发酵条件及中间控制要点
(1)溶氧的影响及控制
链霉菌的临界溶氧浓度（critical value of dissolved oxygen concentration）约为0.001 mol/L
在100 L发酵罐中，搅拌转速应在300~500 rpm
表 搅拌转速与链霉素的合成(100Ｌ罐)
种子罐扩大培养
种子罐培养为2～3级，可根据发酵罐的体积 大小和接种量来确定。
接种量一般都为10％左右
链霉素的发酵培养基
1. 碳源
1. 葡萄糖是链霉素发酵的最适碳源 2. 总量一般在10％以上
2. 氮源
1. 有机氮源包括黄豆饼粉、玉米浆、蚕蛹粉、酵母粉和麸 质水，其中以黄豆饼粉为最佳，其他可作为辅助氮源。
氨基糖苷类抗生素抑制蛋白质合成，最终导致敏 感细菌细胞膜蛋白质的合成障碍，膜通透性增加， 细胞内K+、腺嘌呤核苷酸、酶等重要物质外漏， 导致细菌死亡。
氨基糖苷类抗生素是无色，溶于水，含多羟基、 多氨基的化合物。
显碱性，可与无机酸或有机酸形成结晶性的盐， 具有亲水性。
大部分氨基糖苷类抗生素是含水的无定形物质， 无特征性熔点，无紫外和红外的特异吸收峰。
链霉双糖胺
stroptobiosamine
稳定性
干粉稳定，但其吸潮后，易于分解破坏 链霉素的水溶液比较稳定，但其稳定性受pH值和温
度的影响较大 链霉素水溶液最稳定的pH值为4.0～4.5。酸与碱对
链霉素都有破坏作用。
双氢链霉素在中性及偏酸性条件下的稳定性与链霉 素相似。因分子没有游离醛基，所以在碱性下则比 链霉素稳定得多。
具有抗结核杆菌作用的氨基糖苷； 具有抗绿脓杆菌活性的氨基糖苷； 抗革兰阳性菌与阴性菌，不抗结核杆菌与绿脓杆菌的
氨基糖苷； 具有特定用途的氨基糖苷。
根据来源分类：
链霉素、卡那பைடு நூலகம்素
来自链霉菌属 新霉素、妥布霉素
天然氨基糖苷类
大观霉素
来自小单胞菌属 庆大霉素、西索米星 小诺米星、福提米
阿米卡星、奈替米星 半合成氨基糖苷类