宏基因组学结课作业

基因组学结课综述宏基因组学的研究与进展
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宏基因组学的研究与进展
摘要:宏基因组学是研究生态群体基因功能和其相互作用的新科学领域以特定生态环境中微小生物遗传物质的总和作为研究对象基本研究策略是通过克隆、异源表达筛选出有用的新基因及其产物宏基因组学为生命学科和药学研究提供了一个强有力的新技术并在包括医学在内的许多领域取得了新成就本述评对宏基因组学的概念、技术和应用作了简要介绍。

关键词：宏基因组学；宏基因组学；基因组文库；序列分析技术
随着人类科学认识论和思维方式的深化，在分子生物学和分子遗传学技术方法的支撑下，顺应21世纪生命科学的发展，在基因组学的基础上诞生了一门崭新的交义学科一宏基因组学(metagenomics) 。

宏基因组学的问世引起世界科学界的极大关注，发展很快，它代表了生命学科今后的研究方向。

本文就宏基因组学的产生、概念、研究的基本策略和方法进行综述。

一、宏基因组学的产生背景
人类基因组计划(human genome project，HGP)的完成促使了基因组功能性研究计划的开展并推动从结构基因组学研究时代进入功能性基因组研究为主的后基因组时代，人体基因的功能研究成为生命科学领域的研究热点[1]。

美国国立环境卫生科学研究所（NIEHS，National Institute of Environmental Health Sciences）与1998年启动了环境基因组计划（EGP，Environmental Genome Project），开展有关人体遗传变异与环境胁迫响应的研究，引起各国科学家的极大关注，它标志着生命科学界将在更深层次上对环境与基因相互作用对人类健康的影响进行系统全面的探究和研究（www。

niehs。

nih。

gov/envgenome/home），环境基因组学（environmental genomics）由此应运而生[2]。

二、环境基因组学的提出与发展
1991年Pace首次提出环境基因组学(environmental genomics)的概念，并在同年构建了第一个通过克隆环境样品中DNA的噬菌体文库，环境基因组学(亦称微生物环境基因组学)的研究受到广泛关注。

1998年美国国立环境卫生科学研究所启动了环境基因组计划(envinonmental genome project，EGP)，开展有关人体遗传变异与环境胁迫相互关系的研究，引起各国科学家的极大关注，标志着生命科学界将在更深层次上对环境与基因相互作用对人类健康的影响进行系统全而的研究。

环境基因组学第一次提出特定生态条件下，全部生物基因组总体概念，这是基因组学的重要进展。

三、微生物基因组学与宏基因组学概念的提出
环境是一个相互作用的复杂体系，又是一个不断变化的动态过程，该体系的生命与非生命的两个方而是不断互为因果，相辅相承的。

为了方便研究，人类把精力集中到特定环境的微生物群体上来。

Handelsman等于1998年提出生命研究对象应是生物环境中全部微小生物的基因组(the genomes of the total micnobiota found in nature)，首次提出针一对特定环境样品中细菌和真菌的基因组总和进行研究的这一宏基因组(metagenome)概念，指出应用宏基因组学研究微生物复杂群落基因组的方法将成为快速发展的领域。

2007年3月，美国国家科学院以“环境基因组学新科学一揭小微生物世界的奥秘”为题发表咨询报告，指出宏基因组学为探索微生物
世界的奥秘提供新的方法，这是继发明显微镜以来研究微生物方法的最重要进展，将是对微生物世界认识的革命性突破。

报告呼吁建立全球宏基因组学研究计划，建议大批量启动中小型宏基因组学研究项目，对自然环境微生物群落(如海水或上壤)、寄生微生物群落(如人体肠胃或口腔)、人为控制环境微生物群落(如污水处理厂或水产养殖厂）等展开研究;启动少量大型综合性项目，对宏基因组学研究方法、技术路线、理论框架和更为复杂的动态微生物系统进行研究。

四、宏基因组学的概念
1、广义宏基因组学的概念
广义宏基因组是指特定环境下所有生物遗传物质的总和，它决定了生物群体的生命现象。

它是以生态环境中全部DNA作为研究对象，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物，研究其功能和彼此之间的关系和相勺_作用，并揭小其规律的一门科学。

宏基因组学使得人们摆脱了物种界限，揭小了更高层次上的生命运动规律。

2、狭义宏基因组学概念
狭义宏基因组学则以生态环境中全部细菌和真菌基因组DNA作为研究对象，它不是采用传统的培养微生物的基因组，包含了可培养和还不能培养的微生物的基因，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物，研究其功能和彼此之间的关系和相互作用，并揭小其规律。

如1998年Handelsman等提出上壤宏基因组学的定义是:上壤微生物群体的全部基因组，并对其进行克隆和功能分析。

由于狭义宏基因组学概念的对象具体、范围局限和研究目标明确，一般文献上所提的宏基因组学，除非特别指明，一般均指的是狭义宏基因组学。

五、宏基因组学研究策略与技术
传统宏基因组学的研究策略主要包括样品采集、宏基因组文库的构建、目标基因的筛选和序列分析等。

在此基础上，随着生物信息学、微生物学和分子生物学等学科的发展，宏基因组技术在以下3个方而取得了明显的进步。

1、完整宏基因组文库的构建
普遍采用的宏基因组建库载体包括粘粒、质粒和细菌人工染色体等。

基于对宏基因组文库各种实际应用的考虑，最近出现了商业化的上壤宏基因组提取试剂盒。

另外，大量内含子的存在以及昂贵的测序费用使宏基因组技术在对真核微生物(原生生物和真菌)的研究中受到了限制。

cDNA文库的构建已被提出来克服这一难题，但真正的解决还有赖于新的测序技术的出现，如454-罗氏焦磷酸测序(目前约有1 /3宏基因组研究是以此技术作为基础的)和Ilhnn ina测序等，每次可产生更多的序列信息，与传统鸟枪法测序相比费用也更低。

2 、快速有效的筛选策略
在目前已有宏基因组筛选策略(基于序列、功能的方法)的前提下，通常采用富集培养手段来提高筛选效率。

Meilleu:等利用序半连续式反应器( sequential fed-batch neactor，SFBR)对样品进行30个循环，在此期间将声值从7逐渐升至8。

5再降到7，同时温度从50℃提高到70 0C，以此来增加抗热耐碱微生物的数量，随后从所建立的宏基因组文库中筛选到1个新的脂肪酶，此酶的最佳反应条件为60℃和PH10。

5 Morimoto及其同事通过向上壤样品中加入3-氯苯甲酸(500 m g /kg)，置于28℃下培养，随后采用PCR-DGGE和宏基因组步移技术从该上壤总DNA中克隆得到完整基因benA，benB和tfdC。

而Yanaada领导的研究小组从马阑尾和白蚁肠道中成功分离出糖基水解酶基因则证明了预扩增反向PCR技术同样
可用于基因的筛选。

另外，样品中已死亡微生物的DNA会影响对活微生物的检测，有文献报道在分离DNA之前将乙锭加入到所提样品中，结果与未进行此处理的样品相比其16SrDNA指纹图谱存在很大的差异。

3、依据新基因表达产物的生物活性水平的筛选
生物活性水平的筛选法以活性测定为基础也即采用各种活性检测手段检测挑选活性克隆子进而对其深入研究绝人部分新发现的生物催化剂或分子化合物是利用这种方式筛选得到的在各种选择性平板上通过可见性状筛选到了产生脂酶、淀粉酶、七叶苷水解酶、甘油脱水酶及抗菌活性的克隆子。

一种有效的方法是构建报告融合子，这些融合子能够对日的基因的表达做出反应，如果这些反应能够通过抗生素抗性或荧光激活细胞分类术进行快速鉴定，就可以对人型文库进行筛选这一策略以生物活性为线索能够发现全新的活性物质或基因，能够快速鉴别有开发潜力的克隆子，但工作量人，效率低，并月_受检测手段的局限而月_必须依赖于功能基因或编码功能蛋自在外源宿主中的表达，这也往往会山于许多基因或基因产物在外源宿主中的不表达或表达后没有活性而降低了筛选效率，只有通过对筛选方法的优化和选择合适的底物及筛选条件，并建立合适的宿主载体系统，才能加快对新的生物催化剂的挖掘和利用。

4、依据新基因表达产物的化合物结构水平的筛选
在一定条件下不同结构的物质在色谱中有不同的峰值通过比较转入和未转入外源基因的宿主细胞或发酵液抽提物的色谱图筛选产生新结构化合物的克隆子如Wang G Y( 2001)等通过对重组克隆子的细胞抽提物与对照宿主细胞抽提物的高压液相色谱图谱进行比较发现了2个产生新结构化合物的克隆获得了5种全新的小分子抗菌化合物这一策略可直接筛选到新结构化合物但不一定有生物活性且工作量人成本高。

5、设计探针和PCR引物法
DNA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一是发现和认识基因多态性的前提PCR是序列分析中最常用的技术对日标序列特异的探针杂交技术也已被用于土壤基因文库的筛选。

根据已知相关功能基因的序列设计探针或PCR引物通过杂交或PCR扩增鉴定出已知基因的同源物进而筛选阳性克隆子这已被证明是鉴定系统发育锚定物和编码有高度保守区域的酶的基因的有效方法2003年KnieLsch A等根据所有已知脱水酶基因的保守序列设计了一对简并PCR引物对宏基因组DNA扩增扩增产物制作探针与宏基因组文库进行杂交筛到两个高甘油脱水酶和1，3-丙二醇脱水酶活性的克隆子有望开发应用于工业生产这一策略有可能筛选到某一类物质中的新分子然而对所有以序列为基础的分析来说一个最人的缺陷在于这一方法是基于保守和已知序列因而被检测的新基因总是与已知的基因相同或类似序列筛选并不依赖于克隆基因在宿主中的表达系统它是依赖于日的基因的保守DNA序列但是序列筛选的局限性在于需要对该功能蛋自已知的编码基因序列进行分析。

6、随机鸟枪法
对基因组文库的随机测序可以获得丰富的信息但需要进行人量的测序和分析工作鸟枪法测序策略则为人规模测序提供了技术保障该方法首先将一条完整的日标序列随机打断成小的片段分别测序然后利用计算机根据序列间的重叠关系进行排序和重新组装并确定它们在基因组中的正确位置应用这种方法研究环境基因组学为筛选新的天然产物提供了一种可选择的途径并可产生人量的信息从中挖掘上白万个新基因揭不不可培养微生物的代谢途径最近Tyson等I对一共生的微生物群体进行了完整的基因组分析。

由于宏基因组DNA来源于一嗜酸性的生物被膜因此对这些DNA的序列进行详细的功能性的分析有可能鉴定一人批能够在极端条件下发挥功用的生物催化剂基因。

Schmeisser C等I利用随机的鸟枪法测序在一种系高度多样性的微生物被膜中获得了约5 000种新的基因序列有力地证明了这一方法的有效性这些鸟枪法产生的序列不仅能对研究的小环境的基因组结构探知一二而月_能够鉴定
很多感兴趣的生物催化剂的基因在这些所鉴定的开放阅读框架中有好儿种是脂肪酶和降解多糖的基因但是该方法耗费人需人量人力和物力而且并不能保证全基因或基因簇的获得[3]。

7、底物诱导基因表达检出法
近期有关文献中介绍了一种阳性克隆高通量的检测手段该方法是基于底物诱导基因表达检出方法SICEX，SICEX主要是用于能利用各种底物诱导的分解代谢型基因的检出并结合生物发光技术利用该方法已经成功地从基因组文库中分离出山芳香族化合物诱导的基因利用这种方法快捷、经济特别是在工业上门1小分子诱导的抗生素的筛选上效率很高此外这些新鉴定和假定的基因的功能性还有待生化试验的认证。

8、微序列法
日前，微序列法是已经得到人力推广使用的高通量技术，其特征是同时并行分析或筛选人量样品微序列技术又称基因芯片就是一种高通量技术，它是采用集约化和平而处理原理，在微小片基上高密度而有序地排列人量基因片段，EST或寡核有酸片段，从而形成DNA 微知阵利用微阵列技术研究微生物环境基因组，可以了解环境样品中微生物群落结构及其基因表达图谱和新的代谢途径，快捷地探测未知DNA基因的功能，进而追踪一些能够高效表达或控制微生物群落重要功能的关键基因以BAC文库筛选为例，BAC文库筛选与传统的以细菌种为单位的筛选相似，也是逐个地鉴定和分析，与传统以细菌种为单位的筛选不同的是BAC文库筛选以DNA片段为单位进行筛选，以携带有外源DNA片段的受体细菌为分析对象它优于传统方法之处在于回避了细菌的人工培养限制，极人地扩展了被筛选细菌种的范围，儿乎能对所有的细菌基因资源进行筛选。

Sebat等利用微序列平台对整个微生物群落基因组进行筛选，鉴定出多个新的微生物种群Wagner等应用DNA微阵列技术对活性污泥中微生物的群落结构进行了研究，获得了人量新的信息。

9、新基因的保存和亚克隆
宏基因组文库构建的主要日的是从中筛选到我们所需要的功能基因，这就决定了对于新基因保存的重要性对于小片段的功能基因，一般通过直接和载体相连，并转化宿主细胞即可针对人片段有时不易操作，或者不能转化，需要打断为较小片段后再克隆，即亚克隆亚克隆只是简单地将已被克隆了的DNA片段从某一载体向另一载体的转换，通常用于构建表达系统，或是将DNA片段转移到特殊的载体上以制备杂交探针或是制备测序用的单链模板亚克隆还可用来对较人的克隆片段上较短区段进行仔细研究，或是将基因转移到能在特定物种中表达的另一载体上。

对于通过分子生物芯片筛选出来的功能基因，可以根据其基因序列选择适合的酶进行酶切，而对于未知的基因，必须先通过采用不同的酶进行尝试酶切，然后再和载体相连接，并再次验证其功能，只有当再次验证的功能和初始时候的完全相同的时候，才能说明亚克隆的成功[4]。

10、序列分析技术的进步
近年发展起来的高通量基因组测序技术，不需要克隆或PCR便能获取大量的DNA序列信息，相应地需要有新的方法来比较这些宏基因组数据，不断进步的序列分析技术以及众多生物信息学工具和数据库的出现将为宏基因组数据的分析提供便利，如针一对原核微生物宏基因组进行分析的软件J Coast、可对多组宏基因组数据进行交互分析和比较的宏基因组分析工具MEGAN等。

由于宏基因组技术提取的是环境总DNA，所以给基因的鉴定归属带来很大困难(这一过程被称为binning)，现今只有5 kb以上的片段可进行有效的鉴定归类，DNA条形码技术已被用来尝试解决这一问题。

此外，比较宏基因组技术、基因芯片技术等均可用于分析宏基因组学序列[5] 。

六、结语
宏基因组学之所以能受到如此的重视，究其在技术上仍属于功能基因组学的范畴，然而它跨越了传统微生物培养的观念，所获得的微生物DNA不受培养条件的影响，可代表自然状态下微生物基因组的动态信息，同时还可对特殊基因的分布和丰度进行推论。

理论上任何环境中的核酸材料都可以通过宏基因组技术进行分析，随着技术的不断更新，研究队伍的不断壮大，被研究微生物生境的不断扩展，越来越多新的功能蛋白被发现。

迄今为止，已从各种环境中筛选获得了众多生物催化剂和其它生物活性分子，并在微生物生态研究中显小出了巨大的潜力，同时宏基因组技术还被应用于医药卫生、古生物学以及其它众多学科领域。

同时我们也应注意到，当前宏基因组学的理论和实践并没达到比较成熟的地步，存在很多有待提高的方而。

宏基因组技术所产生的庞大的DNA序列信息给生物信息学提出了巨大的挑战，很多无法鉴定的基因产物也制约了其进一步发展。

因此，宏基因组学还存在很大的发展空间。

参考文献
1. 楚雍烈and 杨娥, 宏基因组学及其技术的研究进展.西安交通大学学报(医学版),
2008(06): p. 601-608.
2. 贺纪正, et al., 宏基因组学(Metagenomics)的研究现状和发展趋势.环境科学学报,
2008(02): p. 209-218.
3. 刘昭前, 肿瘤药物基因组学研究进展.肿瘤药学, 2011(02): p. 82-89.
4. 强慧妮, et al., 宏基因组学在发现新基因方面的应用.生物技术, 2009(04): p. 82-8
5.
5. 孟飞, et al., 宏基因组与宏基因组学.中国生物化学与分子生物学报, 2010(02): p.
116-120.。