体外筛选具黄嘌呤氧化酶抑制活性的天然产物

体外筛选具黄嘌呤氧化酶抑制活性的天然产物近年来,随着人们生活水平的不断提高,痛风的发病率也呈逐渐上升趋势。痛风是由于体内嘌呤代谢紊乱,产生尿酸过多或尿酸排泄过少而导致血中尿酸升高,尿酸盐结晶沉积在组织中引起的反复发作性炎症疾病。

临床上治疗痛风的方法主要包括促进尿酸排泄和抑制尿酸生成。其中,通过抑制黄嘌呤氧化酶活性减少尿酸的生成被认为是治疗痛风的最有效的方法之一。

体内次黄嘌呤可在黄嘌呤氧化酶的催化下生成黄嘌呤,进一步生成尿酸,故抑制黄嘌呤氧化酶的活性可显著降低尿酸的生成。目前临床应用的抗痛风药物的不良反应越来越突出,人们开始倾向于从天然产物中筛选具有抗痛风活性的化学成分。

我国中药资源丰富、中药的化学成分结构多样,作用靶点众多,因此从中药中筛选高效、低毒的黄嘌呤氧化酶抑制剂具有良好的应用前景。黄嘌呤氧化酶抑制剂的体外筛选方法包括紫外分光光度法、电化学法、超高效液相色谱法等,但都存在不同的缺点,因此,本课题拟基于高效液相色谱(HPLC)建立一种简单、快捷、准确的体外筛选方法,并利用建立的方法筛选中药及天然产物中具有黄嘌呤氧化酶抑制活性的先导化合物,为抗痛风新药的研究提供理论依据。

目的建立基于HPLC体外筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的新方法;利用该方法考察具有抗痛风活性中药的黄嘌呤氧化酶抑制活性;选择活性最好的中药作为研究对象进行活性追踪分离,以期获得活性较好的先导化合物。方法通过HPLC测定酶促反应体系中底物黄嘌呤在反应前后含量的变化,建立体外筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法。

色谱条件如下:Agilent SB-C18柱,4.6 mm′250 mm,5mm;流动相,0.02

mol·L-1 KH2PO4(含甲醇1%);流速,1.0 m L·min-1;进样量,20m柱温,室温;检测波长,254 nm。利用建立的方法对文献报道具有抗痛风活性的14味中药,即苏木、海桐皮、牡丹皮、秦皮、虎杖、威灵仙、玉米须、土茯苓、金钱草,使君子、葛花、秦艽、高良姜和樗白皮进行了黄嘌呤氧化酶抑制活性的考察,并对其中抑制活性最好的中药牡丹皮在活性追踪指导下进行了化学成分研究,结合质谱和核磁数据,对得到的单体化合物的结构进行了鉴定,并对其黄嘌呤氧化酶抑制活性进行了考察。

结果基于HPLC体外筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法线性关系良好,精密度、稳定性、重复性、回收率结果均符合方法学考察的要求。利用该方法对14味中药进行筛选,发现使君子、苏木、虎杖和牡丹皮四味中药70%乙醇提取物的酶抑制作用较强,其IC50分别为10.04、8.02、2.06和1.36 mg·m L-1。

对活性最好的中药牡丹皮进行活性成分追踪,从其乙酸乙酯和正丁醇部位分得15个化合物,分别鉴定为没食子酸(1),没食子酸甲酯(2),没食子酸乙酯(3),槲皮素(4),儿茶素(5),胡萝卜苷(6),芍药苷(7),牡丹苷D(8),4-O-甲基氧化芍

药苷(9),没食子酰氧化芍药苷(10),丹皮酚(11),丹皮酚原苷(12),没食子酰氧化芍药苷B(13),丹皮酚新苷(14)和没食子氧化芍药苷D(15)。进一步活性筛选发现,化合物1-5,10,13和15具有黄嘌呤氧化酶抑制活性,其中化合物1-3,10,13和15活性较强,其IC50分别为2.04,1.91,3.60,0.75,1.28,0.97 mmol·L-1。

此外,针对活性较好的苏木,对前期本课题组分离得到的24个单体化合物进行活性筛选,发现化合物7,3’,4’-三羟基-3-苄基-2氢-苯并吡喃,3-去氧苏木酮B,苏木查尔酮和原苏木素A具有一定的活性。结论基于HPLC法体外筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法操作简单、快速、可靠且易推广,为黄嘌呤氧化酶抑制剂

的初步筛选提供了新途径。

利用上述建立的方法从中药牡丹皮中获得8个有活性的单体化合物。