薄层色谱扫描法培训课件
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硅胶H板是没有外加黏合剂。
氧化铝板以氧化铝作为固定相,可以分离萜类, 生物碱类,脂肪族及芳香族化合物。
薄层色谱扫描法
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(二)点样
1 、一般为圆点状或窄细的条带状; 点样基线距底边10-15mm; 圆点状直径一般不大于3mm; 条带宽度一般为5-10mm; 点间距离不少于8mm。
2 、点样是薄层色谱的第一步,也是关键的一步,它既关系到 能否得到可以重现的薄层色谱,也关系到定量测定结果的准 确与否,点样量不宜过大,最好控制在10μl以下,点样过多或 原点“超载”,展开剂产生“绕行”现象,使斑点拖尾或重叠, 致使扫描峰形不对称,或达不到基线分离。
薄层色谱扫描法
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(一)吸附剂性能及薄层质量
2、薄层:薄层厚度会影响定量结果,厚度下 降,展开后斑点扩散较严重,影响定量结果。 用透射法测定时,峰面积值随薄层厚度下降 而减小,用反射法测定,峰面积值随薄层厚 度下降而增加。
因此对吸附剂及薄层性能的规格化是薄层 色谱重现性及定量准确性的先决条件。
薄层色谱扫描法
薄层色谱扫描法
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5、扫描方式
(1)线性扫描:用一束比待测斑点略宽的狭窄
光带沿展开方向做单向等速扫描。适于形状
较规则斑点的扫描。在进行荧光测定时一般
只用线性扫描。
(2)锯齿扫描:使用微小正方形光束沿展开方
向扫描的同时,在垂直于展开方向进行往复
式扫描,扫描过程中光束的运动轨迹呈锯齿
形或矩形,它对于形状不规则或分布不均匀
用展开剂将展开缸及薄层板饱和后再进行展开就可以消 除边缘效应,饱和时间的长短因展开剂极性以及比例不同而
薄层色谱扫描法
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(三)展开
1、预饱和 薄层各个部分对展开剂蒸气的预吸附程度不同,会影响色
谱分离,因此当用展开剂时,先将薄层及展开缸进行预饱和, 以便得到重现的色谱图。 2、相对湿度:50%-60%较适宜
相对湿度过大影响薄层活度,吸附剂吸附能力下降,分离 效果不理想。 3、温度:一般18-25℃较适宜
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薄层板的种类
硅胶G板、硅胶GF254板、硅胶H板、氧化铝板。 硅胶G板以石膏作为黏合剂;
硅胶GF254板是添加荧光指示剂;常用的荧光指示 剂有两种:一种是锰激活的硅酸锌(Zn2SiO4:Mn), 在254nm波长下能发出荧光;另一种是银激活的硫 化锌、硫化镉(ZnS.CdS:Ag),在366nm波长下能 发出荧光。我们常用的是硅胶GF254板。
温度变化会影响组分在两相间的分配,被分离物质的Rf值 应在0.2-0.8较适合,Rf值太大,斑点易扩散,扫描重现差,Rf 值太小,斑点没有完全展开,扫描结果不能代表真实浓度。
薄层色谱扫描法
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4 、边缘效应:同一化合物,在同一块薄层板上,用同一混 合展开剂,在同一展开槽内展开后,薄层中间部分的斑点比 薄层两侧边缘处的斑点的Rf值小。
薄层色谱扫描法
一、薄层色谱扫描法简介
二、影响薄层扫描定量的因素
三、介绍CAMAG薄层扫描仪
薄层色谱扫描法
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一、薄层色谱扫描法简介
薄层色谱扫描法
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1、简述
薄层色谱扫描法是指用一束一定波长、 一定强度的紫外或可见光对薄层板进行 扫描,测定薄层板上的样品斑点对光的 吸收来自百度文库度或斑点经激发后产生的荧光强 度。所得到的图谱及积分数据可用于药 品的鉴别、检查及含量测定。
(3)荧光淬灭法:利用某些化合物减弱吸附剂
中荧光剂的紫外吸收强度而进行定量的方 法。由于薄层板各部分荧光强度不均匀,对 定量不太适用,而是便于斑点的定位。
薄层色谱扫描法
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3、测量方式
(1)透射法:测定照射光穿透样品斑点后 光的吸收情况。
(2)反射法:样品斑点对照射光的反射情 况进行测定的方法。
薄层色谱扫描法
薄层色谱扫描法
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二、影响薄层扫描定量的因素
薄层色谱扫描法
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(一)吸附剂性能及薄层质量
1、吸附剂: (1)吸附剂颗粒大小,分布均匀程度能影响分离度 和检出限度。小颗粒且分布均匀的吸附剂,分离度 好,灵敏度高。 (2)吸附剂的含水量影响薄层活度,如果大气湿度 过大,吸附剂含水量过高,导致薄层活度过低,就 会影响分离效果,所以在点样前薄层板应进行活化 在110℃干燥30分钟。
的斑点扫描重复性较好,但扫描速度较慢。
薄层色谱扫描法
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6、定量方法
(1)外标法:如果标准曲线经过原点,可用一点法校正;如 果不通过原点,采用二点法校正,必要时用多点校正法。测 定时,供试品溶液和对照品溶液应交叉点于同一薄层板上, 每份供试品溶液点样不得少于2个,对照品每一浓度不得少 于2个,其计算结果的相对平均偏差不得大于5%。计算公式:
C=kA+b (kA+b)×稀释倍数 点样量×称样量 (2)内标法:将内标加入供试品溶液和对照品溶液中以峰面 积的比值为定量依据.由于内标物的选择比较困难,目前应 用较少。 内标物:a.在样品溶液中加入一种在样品溶液中不存在的, b.性质与被测物质类似且又与样品中被测成分得 易分离的纯化物,
薄层色谱扫描法
薄层色谱扫描法
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中药材:山豆根、槲寄生、女贞子、牛 黄、两面针、黄连等; 中成药:六味地黄丸(浓缩丸)、元胡 止痛片、清肺消炎丸、二妙丸、二至丸、 九分散等;
薄层色谱扫描法
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2、检测方法
(1)吸收法:扫描时测定薄层板上的样品斑点 对光吸收强度的方法。
(2)荧光法:测定样品斑点经激发后产生的荧 光强度的方法。
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4、测光形式
(1)单波长扫描:使用一种波长的光束对薄层进行扫 描。适用于分离度好,背景干扰小的薄层色谱。 (2)双波长扫描:用测定波长和参比波长分别扫描薄 层后,测定样品斑点在两波长下的吸收度之差,可 减少分离度欠佳的组分间的相互干扰,并减少薄层 板的背景干扰,能显著改善基线的平稳性。操作时 应选择待测斑点无吸收或最小吸收的波长作为参比 波长。
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7、系统适用性试验
(1)检测灵敏度:指用于限量检查时,被测成分能 被检出的最低量。 (2)分离度:用于限量检查或含量测定时,要求定 量峰与相邻峰之间有较好的分离度,应大于1.0。 (3)重复性:指同一薄层板上同一供试品溶液相同 浓度的数个斑点,扫描结果的偏差。不显色直接扫 描,相对标准偏差应不大于3.0%,显色后扫描,相 对标准偏差应不大于5.0%。
氧化铝板以氧化铝作为固定相,可以分离萜类, 生物碱类,脂肪族及芳香族化合物。
薄层色谱扫描法
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(二)点样
1 、一般为圆点状或窄细的条带状; 点样基线距底边10-15mm; 圆点状直径一般不大于3mm; 条带宽度一般为5-10mm; 点间距离不少于8mm。
2 、点样是薄层色谱的第一步,也是关键的一步,它既关系到 能否得到可以重现的薄层色谱,也关系到定量测定结果的准 确与否,点样量不宜过大,最好控制在10μl以下,点样过多或 原点“超载”,展开剂产生“绕行”现象,使斑点拖尾或重叠, 致使扫描峰形不对称,或达不到基线分离。
薄层色谱扫描法
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(一)吸附剂性能及薄层质量
2、薄层:薄层厚度会影响定量结果,厚度下 降,展开后斑点扩散较严重,影响定量结果。 用透射法测定时,峰面积值随薄层厚度下降 而减小,用反射法测定,峰面积值随薄层厚 度下降而增加。
因此对吸附剂及薄层性能的规格化是薄层 色谱重现性及定量准确性的先决条件。
薄层色谱扫描法
薄层色谱扫描法
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5、扫描方式
(1)线性扫描:用一束比待测斑点略宽的狭窄
光带沿展开方向做单向等速扫描。适于形状
较规则斑点的扫描。在进行荧光测定时一般
只用线性扫描。
(2)锯齿扫描:使用微小正方形光束沿展开方
向扫描的同时,在垂直于展开方向进行往复
式扫描,扫描过程中光束的运动轨迹呈锯齿
形或矩形,它对于形状不规则或分布不均匀
用展开剂将展开缸及薄层板饱和后再进行展开就可以消 除边缘效应,饱和时间的长短因展开剂极性以及比例不同而
薄层色谱扫描法
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(三)展开
1、预饱和 薄层各个部分对展开剂蒸气的预吸附程度不同,会影响色
谱分离,因此当用展开剂时,先将薄层及展开缸进行预饱和, 以便得到重现的色谱图。 2、相对湿度:50%-60%较适宜
相对湿度过大影响薄层活度,吸附剂吸附能力下降,分离 效果不理想。 3、温度:一般18-25℃较适宜
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薄层板的种类
硅胶G板、硅胶GF254板、硅胶H板、氧化铝板。 硅胶G板以石膏作为黏合剂;
硅胶GF254板是添加荧光指示剂;常用的荧光指示 剂有两种:一种是锰激活的硅酸锌(Zn2SiO4:Mn), 在254nm波长下能发出荧光;另一种是银激活的硫 化锌、硫化镉(ZnS.CdS:Ag),在366nm波长下能 发出荧光。我们常用的是硅胶GF254板。
温度变化会影响组分在两相间的分配,被分离物质的Rf值 应在0.2-0.8较适合,Rf值太大,斑点易扩散,扫描重现差,Rf 值太小,斑点没有完全展开,扫描结果不能代表真实浓度。
薄层色谱扫描法
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4 、边缘效应:同一化合物,在同一块薄层板上,用同一混 合展开剂,在同一展开槽内展开后,薄层中间部分的斑点比 薄层两侧边缘处的斑点的Rf值小。
薄层色谱扫描法
一、薄层色谱扫描法简介
二、影响薄层扫描定量的因素
三、介绍CAMAG薄层扫描仪
薄层色谱扫描法
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一、薄层色谱扫描法简介
薄层色谱扫描法
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1、简述
薄层色谱扫描法是指用一束一定波长、 一定强度的紫外或可见光对薄层板进行 扫描,测定薄层板上的样品斑点对光的 吸收来自百度文库度或斑点经激发后产生的荧光强 度。所得到的图谱及积分数据可用于药 品的鉴别、检查及含量测定。
(3)荧光淬灭法:利用某些化合物减弱吸附剂
中荧光剂的紫外吸收强度而进行定量的方 法。由于薄层板各部分荧光强度不均匀,对 定量不太适用,而是便于斑点的定位。
薄层色谱扫描法
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3、测量方式
(1)透射法:测定照射光穿透样品斑点后 光的吸收情况。
(2)反射法:样品斑点对照射光的反射情 况进行测定的方法。
薄层色谱扫描法
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二、影响薄层扫描定量的因素
薄层色谱扫描法
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(一)吸附剂性能及薄层质量
1、吸附剂: (1)吸附剂颗粒大小,分布均匀程度能影响分离度 和检出限度。小颗粒且分布均匀的吸附剂,分离度 好,灵敏度高。 (2)吸附剂的含水量影响薄层活度,如果大气湿度 过大,吸附剂含水量过高,导致薄层活度过低,就 会影响分离效果,所以在点样前薄层板应进行活化 在110℃干燥30分钟。
的斑点扫描重复性较好,但扫描速度较慢。
薄层色谱扫描法
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6、定量方法
(1)外标法:如果标准曲线经过原点,可用一点法校正;如 果不通过原点,采用二点法校正,必要时用多点校正法。测 定时,供试品溶液和对照品溶液应交叉点于同一薄层板上, 每份供试品溶液点样不得少于2个,对照品每一浓度不得少 于2个,其计算结果的相对平均偏差不得大于5%。计算公式:
C=kA+b (kA+b)×稀释倍数 点样量×称样量 (2)内标法:将内标加入供试品溶液和对照品溶液中以峰面 积的比值为定量依据.由于内标物的选择比较困难,目前应 用较少。 内标物:a.在样品溶液中加入一种在样品溶液中不存在的, b.性质与被测物质类似且又与样品中被测成分得 易分离的纯化物,
薄层色谱扫描法
薄层色谱扫描法
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中药材:山豆根、槲寄生、女贞子、牛 黄、两面针、黄连等; 中成药:六味地黄丸(浓缩丸)、元胡 止痛片、清肺消炎丸、二妙丸、二至丸、 九分散等;
薄层色谱扫描法
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2、检测方法
(1)吸收法:扫描时测定薄层板上的样品斑点 对光吸收强度的方法。
(2)荧光法:测定样品斑点经激发后产生的荧 光强度的方法。
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4、测光形式
(1)单波长扫描:使用一种波长的光束对薄层进行扫 描。适用于分离度好,背景干扰小的薄层色谱。 (2)双波长扫描:用测定波长和参比波长分别扫描薄 层后,测定样品斑点在两波长下的吸收度之差,可 减少分离度欠佳的组分间的相互干扰,并减少薄层 板的背景干扰,能显著改善基线的平稳性。操作时 应选择待测斑点无吸收或最小吸收的波长作为参比 波长。
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7、系统适用性试验
(1)检测灵敏度:指用于限量检查时,被测成分能 被检出的最低量。 (2)分离度:用于限量检查或含量测定时,要求定 量峰与相邻峰之间有较好的分离度,应大于1.0。 (3)重复性:指同一薄层板上同一供试品溶液相同 浓度的数个斑点,扫描结果的偏差。不显色直接扫 描,相对标准偏差应不大于3.0%,显色后扫描,相 对标准偏差应不大于5.0%。