限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶名词解释
限制性核酸内切酶名词解释限制性核酸内切酶（RestrictionNucleases）是一类酶，在一个特定的基因序列中，它能够以高精度地找到并且切割目标片段。
它的另一个叫法是限制性内切酶，是一种分子生物学中的重要工具，通常用来分离和分析特定的DNA片段，从而帮助研究人员全面了解和研究基因组。
这类酶被发现于1960年，并于1972年获得诺贝尔生理学或医学奖，因为它们在分子生物学方面具有重要的意义。
限制性核酸内切酶是一种能够将双链DNA分割成其他片段的酶。
它们是自然界中存在的，细菌通过限制内切酶来防御抗生素和其他有害细菌，另一方面，研究人员也可以使用它们来分离和分析DNA片段，从而了解基因信息和细胞运行机制。
在这种情况下，限制性核酸内切酶能够将双链DNA识别为其特定目标序列，在这个特定序列处将所有字母（A，T，G，C）切断，并将其分割成单链片段。
每个限制性核酸内切酶都有一个特定的识别序列，只有细菌有多种不同的内切酶，这些酶可以识别每个特定的目标序列，并且可以在这些序列处将双链DNA切割成片段。
限制性核酸内切酶的工作原理和精度使它们成为了分子生物学方面的重要工具。
它们可以用来识别和分析基因片段，而这些片段可以用来研究基因组，并了解基因如何影响细胞运作及机体发育，以及疾病随之而来的基因变化。
限制性核酸内切酶可以用来分离DNA，而这也是各种分子生物学应用所必需的。
例如，它们可以用来制作基因组图谱、分析基因组差异、复制特定基因以及在真核细胞和原核细胞等不同的生物体中测量基因表达的等，在医学研究中也有很大的应用。
此外，由于限制性核酸内切酶的超精确切割功能，它们被广泛应用于基因工程和转基因技术中，可以帮助开发者们分离和重组特定的基因，以获得想要的表型。
这些技术也能够应用于改变植物的物种，用以改善植物的各种性状，例如增加水合作用，减少营养价值，增强抗病性能，增加耐盐性以及改变其他特性。
总之，限制性核酸内切酶是一种重要的酶，它的工作原理和精确的切割功能使它成为了分子生物学研究中的重要工具，并且它还在基因工程和转基因技术中有着广泛的应用。
限制性核酸内切酶
生理意义
限制作用实际就是限制酶降解外源DNA ，维护宿主遗传稳定的保护 机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受 到保护。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目 的。所以，能产生防御病毒侵染的限制酶的细菌，其自身的基因组中 可能有该酶识别的序列，只是该识别序列或酶切位点被甲基化了。但 并不是说一旦甲基化了，所有限制酶都不能切割。大多数限制酶对 DNA甲基化敏感，因此当限制酶目标序列与甲基化位点重叠时，对酶 切的影响有3种可能，即不影响、部分影响、完全阻止。对甲基化 DNA的切割能力是限制酶内在和不可预测的特性，因此，为有效的切 割DNA，必须同时考虑DNA甲基化和限制酶对该类型甲基化的敏感 性。另外，现在很多商业限制酶专门用于切割甲基化DNA。
E
Escherichia
(属)
co
coli
(种)
R
RY13
(品系)
I
的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限 制酶分为三种类型，分别是第一型(Type I)、第二型(Type Ⅱ) 及第三型(Type Ⅲ)。
类型
第一型限制酶 同时具有修饰(modification)及识别切割(restriction)的作用;另有识别 (recognize)DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距离 识别位(recognition site)可达数千个碱基之远。例如:EcoB、EcoK。
第二型限制酶 只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行。所识别的位置多为短的回文 序列(palindrome sequence);所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列。是遗 传工程上，实用性较高的限制酶种类。例如:EcoRI、HindⅢ。
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶：是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
限制性核酸内切酶的分类：依照限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，别离是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。
第一型限制酶同时具有修饰(modification)及认知切割(restriction)的作用；还有认知(recognize)DNA 上特定碱基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距离认知位(recognition site)可达数千个碱基之远,并非能准确信位切割位点，因此并非经常使用。
例如：EcoB、EcoK。
第二型限制酶只具有认知切割的作用，修饰作用由其他酵素进行。
所认知的位置多为短的回文序列(palindrome sequence)；所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。
是遗传工程上，有效性较高的限制酶种类。
例如：EcoRI、HindIII。
第三型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。
可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对，并非能准确信位切割位点，因此并非经常使用。
例如：EcoPI、HinfIII。
限制酶在遗传学方面的应用：1、在甚因工程方面利用能产生“粘性结尾”的限制酶, 进行DNA的体外重组, 是较为方便的, 只要用同一限制酶处置不同来源的DNA, 由于所产生的水解片段具有相同的粘性结尾, 能够彼此“粘合”,再经连接酶处置, 就成为重组DNA分子了. 目前, 基因工程上, 限制酶要紧应用于以下两方面（1）目的基因与载体的重组细菌细胞中的限制酶能水解外源DNA , 因此必需通过适当的载体(质粒或噬菌体)的帮忙才能将外源DNA引人受体细胞并在其中增殖和表达。
将供体DNA与载体用一样的限制酶处置, 使载体带上各类各样的外源DNA片断, 然后引人受体细菌细胞增殖, 菌细胞增殖, 再挑选出所需的菌株, 便取得带有某一目的基因的繁衍系.用这种方式, 已成功地将酵母菌的咪哇甘油磷酸脱水酶基因、夕一异丙基苹果酸脱氢酶基因和色氨酸合成酶基因通过几噬菌体转人大肠杆菌,并表达了信息.（2）建造新的基因载体作为基因载体,在引人受体细胞后, 必需有较高的复制率, 以求取得大量的基因产物；必需具有一个选择性标志, 以便挑选；还要有一最多种限制酶的作用位点（每种酶只有一个切口）；也要求利用平安。
限制性核酸内切酶名词解释
限制性核酸内切酶名词解释限制性核酸内切酶（RestrictionNucleases,RNases）是一类重要的核酸分子分析工具，是由胞壁杆菌和放线菌等微生物中编码的特定核酸酶类别。
它可以特异性的切割DNA和RNA的特定序列，对研究DNA和RNA的结构和功能有着重要的作用。
限制性核酸内切酶的分子结构基本上是由多聚腺苷酸（polypeptide）和双聚腺苷酸（dipeptide）组成的。
此外，它们还包含辅酶（cofactor），例如Mg2+或Ca2+、K+等，并且需要这些辅酶才能激活其具有酶活性。
一个限制性核酸内切酶在一次反应中可以检测出多个DNA序列，而且能够辨识具有同系特征特异性碱基对，尽量减少大量的氧化废物产生。
与其他核酸分子分析工具不同的是，限制性核酸内切酶具有单端可切或双端可切的特性，可以选择性地切割DNA分子的特定序列，其切割后的片段可以进一步用于分子生物学技术，如DNA测序、PCR及DNA杂交等。
例如，细菌DNA内切酶BamHI以TGT^AAT为切割位点，能有效地将DNA分子切断，切割后可以得到二条内切片段，分别以TGT和AAT为3端，以及一条5末端非切片段；而HpaII以C^CGG为切割位点，切割后可以得到二条内切片段，分别以C和CGG为5端，以及一条3末端的非切片段。
此外，限制性核酸内切酶还可用于检测DNA片段的克隆和定位，以及调控基因表达，控制蛋白质翻译等用途，因此，它们在遗传学、分子生物学研究中起着重要的作用。
它们能够解析特定DNA序列，同时保留它们的原始特征，有助于研究者对其进行详细的调查。
在生物技术的应用中，使用限制性核酸内切酶可以改变DNA序列，实现重组DNA的目的，创造各种抗性等目的。
因此，限制性核酸内切酶的重要性不言而喻。
它们是研究 DNARNA 构和功能的重要工具，同时也是实现技术转化的重要基础。
它们可以用于检测DNA片段，改变序列，以及调控基因表达等多种用途，同时也可以做出有意义的蛋白质和重要生物体系。
限制性核酸内切酶
2. DNA的甲基化程度
大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒 dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。
基因工程中必须使用甲基化酶失活突变 的菌株。
3. 温度
齐平末端：在识别序列内的对称轴上切割，其 切割产物具平头末端（不易重新连接）。
粘性末端：在识别序列2条链对应位上错位切割， 有5’端突出的粘性末端和3’端突出的粘性末端。
粘性末端的意义：粘性末端突出的单链部分可以与相同的酶或 同尾酶切割得到的粘性末端的单链部分互补配对。
粘性末端和平齐末端的动画对比
四 限制性内切酶的识别序列
• EcoRⅠ的识别序列 GAATTC
•
CTTAAG
• Hind Ⅲ的识别序列 AAGCTT
•
TTCGAA
• BamHⅠ的识别序列 GCATCC
•
CCTAGG
• 从以上举例的各种限制性酶切酶的识别序列看出， 它们具有共同的规律性，呈旋转对称或二重互补 对称。
• 有的限制性酶切酶可识别两种以上的核酸 序列。
不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大 多数是37oC，少数要求40-65oC。
酶
最适 温度oC
酶
最适 温度oC
酶
Apa I 30 Apy I 30 Ban I Bcl I 50 BstE II 60 Mae I Mae II 50 Mae III 55 Sma I Taq I 65
最适 温度 oC
特性
限制和修饰活 性
内切酶的蛋白 结构
I类内切酶 单一多功能的酶 3种不同的亚基
酶切检测实验报告
一、实验目的1. 理解并掌握限制性核酸内切酶（RE）的原理及其在分子生物学中的应用。
2. 掌握质粒DNA的提取方法。
3. 学习并实践质粒DNA的酶切技术。
4. 掌握琼脂糖凝胶电泳技术及其在DNA分析中的应用。
5. 分析酶切结果，鉴定目的基因。
二、实验原理限制性核酸内切酶（RE）是一类能够识别特定的DNA序列并在该序列处切割双链DNA的酶。
它们在分子生物学中具有广泛的应用，如基因克隆、基因编辑、基因表达调控等。
质粒DNA是常用的克隆载体，其提取方法主要有碱裂解法、盐析法等。
本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
酶切是将质粒DNA切割成大小不同的片段，通过琼脂糖凝胶电泳技术分离这些片段，从而鉴定目的基因。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分析技术，其原理是利用DNA分子在琼脂糖凝胶中的迁移速率差异进行分离。
在电场作用下，DNA分子带负电荷，会向正极移动。
DNA分子的大小与其迁移速率成反比，因此，通过比较不同片段的迁移距离，可以鉴定DNA片段的大小。
三、实验材料1. 质粒DNA2. 限制性核酸内切酶（RE）3. 琼脂糖凝胶4. TAE缓冲液5. DNA marker6. 电泳仪7. 显色剂8. 紫外灯四、实验步骤1. 质粒DNA提取- 将含有质粒DNA的菌液接种于含有抗生素的LB培养基中，37℃培养过夜。
- 取适量菌液，加入等体积的碱裂解液，混匀，室温放置5分钟。
- 加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10分钟。
- 12,000 rpm离心5分钟，弃上清。
- 加入700 μL 70%乙醇，混匀，室温放置5分钟。
- 12,000 rpm离心5分钟，弃上清。
- 加入50 μL无菌水，混匀，即得质粒DNA。
2. 酶切- 取10 μL质粒DNA，加入10 μL限制性核酸内切酶缓冲液，混匀。
- 加入1 μL限制性核酸内切酶，混匀。
- 37℃水浴反应3小时。
3. 琼脂糖凝胶电泳- 配制琼脂糖凝胶，加入适量的DNA marker。
限制性内切核酸酶名词解释
限制性内切核酸酶名词解释限制性内切核酸酶(restrictive endoribonuclease)能识别特异的核苷酸序列，它们不与单链的核酸共价结合，而是以共价键切开单链核酸，然后再将切开的片段两两链接起来形成完整的分子。
限制性内切核酸酶分为限制性激酶和限制性内切酶。
限制性内切核酸酶能有效降解RNA或DNA中的碱基、磷酸二酯键、侧链基团等核酸结构，从而阻止了DNA或RNA进入蛋白质或脂类等高分子化合物中，使其失去遗传功能或者发生改变。
它主要作用于核苷酸的3'-OH末端。
限制性内切核酸酶(restrictive endoribonuclease)分为限制性激酶和限制性内切酶。
限制性激酶仅对特定核苷酸序列敏感，而限制性内切酶则可识别并裂解特定核苷酸序列，并且有特异性。
限制性内切核酸酶能有效降解RNA或DNA中的碱基、磷酸二酯键、侧链基团等核酸结构，从而阻止了DNA或RNA进入蛋白质或脂类等高分子化合物中，使其失去遗传功能或者发生改变。
它主要作用于核苷酸的3'-OH末端。
这类酶通常比较稳定，多数不会自动水解底物，即使在无酶情况下也可保持活性。
由于它可被一些长寿命的蛋白质修饰，故认为限制性内切核酸酶具有超活性。
限制性内切核酸酶已经广泛应用于生物化学研究及临床诊断。
1、限制性内切核酸酶识别DNA或RNA的模板链的序列，并且限制性内切酶能够切割双链DNA分子； 2、限制性内切核酸酶与细胞内或细胞外的另一种酶——限制性核酸内切酶结合，对它进行识别和剪切； 3、当产生的酶与目标分子连接时，目标分子便能被释放出来，这就导致了基因表达的调控。
在基因工程中，将目标DNA的片段通过限制性内切酶切割之后，将两端的切口连接起来，这样就可以用连接酶将DNA片段连接起来，合成为双链DNA，进而实现DNA指导蛋白质的表达。
限制性内切核酸酶名词解释：是指能识别核苷酸序列并将其分解成小片段的内切核酸酶。
限制性内切核酸酶的识别序列是由3’端或5’端内含子组成的核苷酸序列。
限制性核酸内切酶一知识讲稿
切割方式独特
详细描述
Ⅲ型限制性核酸内切酶的切割方式也较为独特，它通常在识 别位点的两侧进行切割，产生具有不同序列和长度的DNA 片段。
总结词
应用潜力大
详细描述
由于Ⅲ型限制性核酸内切酶的独特特性和切割机制，它在 基因组学、生物信息学和基因治疗等领域具有较大的应用 潜力。
03
限制性核酸内切酶的作 用机制
04
限制性核酸内切酶的基 因工程应用
基因克隆与鉴定
基因克隆
限制性核酸内切酶能将DNA切割成特定序 列的片段，这一特性使得科学家能够通过切 割和重新连接DNA片段，将感兴趣的基因 从复杂的基因组中分离出来，从而实现基因 克隆。
基因鉴定
限制性核酸内切酶可以用来分析特定基因的 表达模式，通过比较不同组织或发育阶段中 特定基因的表达水平，可以了解该基因的功
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B型限制性核酸内切酶
总结词
切割位点固定
详细描述
B型限制性核酸内切酶的切割位点通常固定，切割后产生具有固定长度和序列的 粘性末端，这使得酶切后的DNA片段容易进行连接和重组。
B型限制性核酸内切酶
总结词
切割效率高
详细描述
B型限制性核酸内切酶具有较高的切割效率，能够在短时间内将大量DNA分子进行切割，提高实验的 效率。
新技术的应用
随着生物技术的不断发展，限制性核酸内切酶的应用前景将更加 广阔，如基因编辑、基因治疗等领域。
安全性和伦理标准的提高
随着人们对生物技术的认识加深，限制性核酸内切酶的安全性和伦 理标准也将不断提高。
法规监管的完善
政府和国际组织将加强对限制性核酸内切酶的法规监管，确保技术 的合理应用和发展。
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限制性内切酶原理
AACNNN3’ TTGNNN5’
HaeⅠ的识别序列
5’NNNGC
GGCCGC NNN3‘
3’NNNCGCCGG
CGNNN5 ‘
NotⅠ 的识别序列
5’粘性末端和3’粘性末端
5’粘性末端
5’NNGCGGCCGC NN3‘ 3’NNCGCCGGCGNN 5 ‘
5’NNNGC-OH P-GGCCGC NNN3‘ 3’NNNCGCCGG-P HO-CGNNN5 ‘
Hsp70A ：Ex-F 5' CGCCA^TATGCCAGCTATCGGAATCGATTTGG 3'
Nde I Hsp70A ：Ex-R 5' GC^GGCCGCATAAAGGTGGGGAGAGCTTACAAC3'
Not I
4 DNA甲基化酶
甲基化酶：可以从活性甲基化合物(如S-腺苷甲 硫氨酸)上将其甲基转移到其他化合物的酶。可 形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核 酸等进行化学修饰形成甲基化产物。
5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’
5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’
5’-UGATCY-3’ 3’-YCTAGU-5’
同裂酶
有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷 酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。识别序列和切 割位点都相同的叫同序同切酶，识别序列相同但 切割位点不同的叫同序异切酶。 例如：HpaⅡ和MspI为同序同裂酶（C^CGG）。 XmaI和SmaI为同序异裂酶，都识别CCCGGG，但 Xma I的切点在C^CCGGG，形成带有CCGG的粘 性末端；而Sma I的切点则在CCC^GGG，形成平 末端。
5’NNNGC-OH
p-GGCCGC NNN3‘
酶切鉴定实验报告
一、实验目的1. 掌握限制性核酸内切酶的酶切原理和应用；2. 学习质粒DNA的提取、纯化方法；3. 掌握琼脂糖凝胶电泳技术及其在DNA分析中的应用；4. 通过酶切鉴定，验证目的基因的插入和表达。
二、实验原理限制性核酸内切酶（Restriction Enzyme）是一种特殊的核酸酶，能够识别特定的DNA序列并在这些序列上切割双链DNA。
根据识别序列的长度和切割方式，限制性核酸内切酶分为两类：I类酶和II类酶。
其中，II类酶在分子生物学实验中应用最为广泛，如EcoRI、BamHI、HindIII等。
酶切鉴定实验的原理是：通过将目的基因与载体连接，构建重组质粒。
然后，利用限制性核酸内切酶对重组质粒进行酶切，观察酶切后的DNA片段长度，以判断目的基因是否成功插入载体。
三、实验材料1. 试剂：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液、T4 DNA聚合酶、dNTPs、琼脂糖、电泳缓冲液、DNA分子量标准等；2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、紫外分光光度计等；3. 样品：重组质粒、载体DNA、目的基因DNA等。
四、实验步骤1. 质粒DNA的提取和纯化（1）取含有重组质粒的细菌，用碱裂解法提取质粒DNA；（2）将提取的质粒DNA进行酚-氯仿抽提和乙醇沉淀，得到纯化的质粒DNA。
2. 重组质粒的构建（1）取目的基因DNA和载体DNA，分别进行PCR扩增；（2）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定目的基因和载体DNA的大小；（3）利用DNA连接酶和T4 DNA连接酶，将目的基因连接到载体上；（4）转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。
3. 酶切鉴定（1）取重组质粒和载体DNA，分别进行酶切反应；（2）将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切后的DNA片段长度；（3）根据酶切结果，判断目的基因是否成功插入载体。
4. 结果分析根据琼脂糖凝胶电泳结果，比较重组质粒和载体DNA的酶切产物。
若重组质粒在目的基因插入位点附近出现新的酶切位点，则说明目的基因成功插入载体。
限制性内切核酸酶名词解释
限制性内切核酸酶名词解释限制性内切核酸酶是一种能够识别并水解脱氧核苷酸侧链的蛋白质，是除磷酸双酯酶之外一类分子量比较大的酶。
这类酶不受其他限制性内切核酸酶或核酸酶的抑制，对许多蛋白质具有高度特异性。
大部分哺乳动物细胞都含有限制性内切核酸酶。
人的成熟红细胞、精子等也含有少量限制性内切核酸酶。
由于限制性内切核酸酶广泛存在于人体各组织细胞中，而且又可以对其进行高效降解，因此常被用于对细胞的活性研究。
现已知道人类有三种典型的限制性内切核酸酶：一种是位于13号染色体上的脊椎动物细胞核DNA限制性内切核酸酶;另一种是位于22号染色体上的鸟类细胞核DNA限制性内切核酸酶，以及一种位于X染色体上的人类细胞核和线粒体DNA限制性内切核酸酶。
最近，在哺乳动物细胞中发现了一种新的DNA限制性内切核酸酶。
限制性内切核酸酶对哺乳动物的DNA和RNA具有很高的专一性。
它们能识别被连接到碱基末端的核苷酸残基，并使脱氧核苷酸（或核糖核苷酸）沿着被切断的核苷酸末端彼此分开。
限制性内切核酸酶也叫做限制性核酸内切酶，是一类在某些条件下可以将DNA或RNA一分为二的特殊的核酸内切酶。
目前发现的限制性内切核酸酶包括3个亚家族，即头甲型限制性内切核酸酶、尾加型限制性内切核酸酶和未定型限制性内切核酸酶。
虽然还没有明确证据表明限制性内切核酸酶与人类癌症、基因突变、血型以及某些疾病的发生和发展有直接关系，但限制性内切核酸酶作为一类具有重要生理功能的酶，在基因工程技术的应用方面显示出巨大潜力。
与基因重组相比，基因修饰是限制性内切核酸酶作用的另一个重要领域。
因为基因修饰也是细胞中经常发生的事情。
限制性内切核酸酶的活性不仅取决于蛋白质的浓度，还取决于温度、 pH值、离子强度、金属离子、抑制剂、酶和DNA模板等多种因素，当这些因素发生变化时，限制性内切核酸酶的活性也会随之改变。
许多实验表明，不同温度和盐浓度对限制性内切核酸酶活性的影响是非常明显的，限制性内切核酸酶活性也随温度的升高而提高。
生物化学--实验十五DNA的限制性内切酶酶切分析
实验十五 DNA的限制性内切酶酶切分析【目的要求】1.掌握限制性核酸内切酶的基本概念、作用特点及作用原理2.熟悉DNA的限制性内切酶酶切分析操作技术及其影响因素3.了解DNA酶解技术生物研究领域的应用【实验原理】限制性内切酶(restriction endonuclease，RE)是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸顺序(一般具有双重对称的回文结构)，并以内切方式水解水解双链DNA的核酸水解酶。
它主要分布于细菌体内，目前已发现1800多种。
根据酶的组成、辅助因子及水解DNA的方式不同，可将限制性内切酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型，而Ⅱ型限制性内切酶是重组DNA技术中常用的限制性内切酶，如Eco RⅠ、BamHⅠ等，它们被誉为分子生物学家的手术刀。
临床上某些遗传病由于基因突变发生在限制性内切酶切割位点，因此当用一定的限制性内切酶切割时，产生的酶切DNA片段大小就会与正常人酶切DNA片段发生差异，因而发生DNA限制性酶切图谱改变，据此可达到基因诊断的目的。
实验选用价格低廉、酶切效果较好的Eco RⅠ(识别位点G↓AATTC)对λDNA进行酶切分析，观察限制性内切酶的特定切割作用及其限制性图谱，理论上可产生21226bp，7421bp，5804bp，5604bp，4878bp和3530bp等不同分子量的DNA片段。
经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外扫描仪下摄影即可观察到λDNA的Eco RⅠ限制性酶切图谱。
【实验准备】一、器材1.恒温水浴箱2.电泳仪和电泳槽3.紫外扫描分析仪4.台式高速离心机5.微波炉6.加样枪、EP管及试管架等二、试剂1．DNA底物λDNA或质粒DNA或制备的肝组织DNA。
2．限制性内切酶Eco RⅠ及其缓冲液购自华美生物工程公司，每种限制性内切酶均配有2种缓冲液，在配套的缓冲液中该限制性内切酶均可获得100%酶切活性。
3．10×TAE 电泳缓冲液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml，加蒸馏水至500ml。
限制性核酸内切酶与核酸内切酶、外切酶
限制性核酸内切酶百科名片其3′→5′外切酶活性使双链DNA分子产生出单链区，经过这种修饰的DNA 再配合使用Klenow酶，同时加进带放射性同位素的核苷酸，便可以制备特异性的放射性探针。
核酸内切酶核酸内切酶（endonuclease）在核酸水解酶中，为可水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸的酶，与核酸外切酶相对应。
从对底物的特异性来看，可分为DNaseⅠ、DNaseⅡ等仅分解DNA的酶；脾脏RNase、RNaseT1等仅分解RNA的酶。
如链孢霉（Neurospora）的核酸酶就是既分解DNA又分解RNA的酶。
一般来说，大都不具碱基特异性，但也有诸如脾脏RNase、RNaseT1等或限制性内切酶那种能够识别并切断特定的碱基或碱基序列的酶。
[1]寡核苷酸，是一类只有20个以下碱基对的短链核苷酸的总称（包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸），寡核苷酸可以很容易地和它们的互补对链接，所以常用来作为探针确定DNA或RNA的结构，经常用于基因芯片、电泳、荧光原位杂交等过程中。
RNA聚合酶科技名词定义中文名称：RNA聚合酶英文名称：RNA polymerase定义1：以一条DNA链或RNA链为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。
所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；酶（二级学科）定义2：以一条DNA链或RNA链为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。
所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞遗传（二级学科）定义3：以DNA或RNA为模板合成RNA的酶。
所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布RNA聚合酶（RNA polymerase）:以一条DNA链或RNA为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。
是催化以DNA为模板（template）、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶。
因为在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关，所以也称转录酶。
酶切回收实验报告(3篇)
第1篇实验日期：2023年X月X日实验地点：生物化学与分子生物学实验室实验目的：1. 掌握限制性核酸内切酶（限制酶）的酶切原理及其应用。
2. 学习并掌握DNA片段的酶切回收技术。
3. 熟悉琼脂糖凝胶电泳的操作流程及结果分析。
实验原理：限制性核酸内切酶是一种能够识别特定的DNA序列并在此位点切割双链DNA的酶。
在分子生物学研究中，限制酶被广泛应用于基因克隆、基因编辑等领域。
酶切回收技术是指利用限制酶切割DNA片段，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，最后通过特定的方法将目的片段从凝胶中回收，以便进行后续的实验操作。
实验材料：1. DNA模板：质粒DNA或基因组DNA。
2. 限制性核酸内切酶：例如HindIII、EcoRI等。
3. 10×限制酶缓冲液。
4. dNTP混合物。
5. Taq DNA聚合酶。
6. 琼脂糖凝胶电泳试剂。
7. 紫外灯。
8. 琼脂糖凝胶回收试剂盒。
9. 实验器材：PCR仪、凝胶成像系统、微量移液器、离心机等。
实验步骤：1. DNA模板制备：- 将质粒DNA或基因组DNA进行PCR扩增，获得目的DNA片段。
- 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增结果。
2. 限制酶酶切：- 将PCR产物加入10×限制酶缓冲液，加入适量的限制酶。
- 在PCR仪上设置合适的温度和时间进行酶切反应。
3. 琼脂糖凝胶电泳：- 将酶切后的DNA样品加入琼脂糖凝胶孔中，进行电泳分离。
- 使用凝胶成像系统观察电泳结果，确定目的片段的位置。
4. 酶切回收：- 根据电泳结果，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒将目的片段从凝胶中回收。
- 将回收的DNA片段进行PCR扩增，检测回收结果。
5. 结果分析：- 根据PCR扩增结果，分析酶切回收的效果。
实验结果：1. DNA模板制备：- PCR扩增结果良好，获得目的DNA片段。
2. 限制酶酶切：- 酶切反应顺利进行，获得酶切片段。
3. 琼脂糖凝胶电泳：- 目的片段位于琼脂糖凝胶的特定位置。
限制性核酸内切酶
目 录
• 限制性核酸内切酶的概述 • 限制性核酸内切酶的分类 • 限制性核酸内切酶的工作原理 • 限制性核酸内切酶的应用 • 限制性核酸内切酶的未来发展
01
限制性核酸内切酶的概述
定义和特性
定义
限制性核酸内切酶是一类能识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定 部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶。
在生物科学领域的应用
基因克隆和DNA重组技 术
限制性核酸内切酶是基因克隆和DNA重组 技术中的关键工具，用于切割和重组DNA 片段。
基因诊断和基因治疗
限制性核酸内切酶可用于检测和纠正基因突变，为 基因诊断和基因治疗提供有效手段。
生物制药和生物技术
限制性核酸内切酶在生物制药和生物技术领 域中用于生产重组蛋白、抗体和治疗性核酸 等生物制品。
双活性酶
02
同时具有切割和磷酸酶活性，如BstAPI。
多活性酶
03
同时具有多种活性，如FokI同时具有切割、磷酸酶和甲基化酶
活性。
03
限制性核酸内切酶的工作原理
识别和切割DNA的过程
识别
限制性核酸内切酶能够识别特定的 DNA序列，通常是4-6个核苷酸组成 的序列。
切割
在识别位点处，限制性核酸内切酶将 DNA链切开，形成两个断开的磷酸二 酯键。
产生黏性末端
限制性核酸内切酶切割DNA后，通常产生具有突出末端的片段，也称为黏性末端 。这种黏性末端可以用于DNA的连接和重组。
04
限制性核酸内切酶的应用
在基因工程中的应用
1 2 3
基因克隆
限制性核酸内切酶能够将DNA分子切割成特定序 列的片段，为基因克隆提供精确的DNA片段。
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• 第一型限制酶 • 同时具有修饰（modification）及识别切割（restriction） 的作用；另有识别（recognize)DNA上特定碱基序列的能 力，通常其切割位点（cleavage site）距离识别位点 （recognition site）可达数千个碱基之远。例如：EcoB、 EcoK。 • 第二型限制酶 • 只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行。所识别 的位置多为短的回文序列（palindrome sequence）；所 剪切的碱基序列通常即为所识别的序列。是遗传工程上， 实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindⅢ。 • 第三型限制酶 • 与第一型限制酶类似，同时具有修饰及识别切割的作用。 可识别短的不对称序列，切割位与识别序列约距24-26个 碱基对。例如：HinfⅢ。
应用实例-3
• [目的]监控MSAP甲基化检测过程,以控制MSAP每 一反应步骤。[方法]利用PBR322质粒作为阳性对 照,全程监控MSAP分析中酶切、连接、预扩与选 扩体系。[结果]PBR322质粒作为阳性对照电泳时 条带有限,可以根据条带有无和位置对MSAP甲基 化检测过程进行全程监控,有助于发现问题的具有 所在。[结论]该研究可以为MSAP技术提供可靠保 障。 MSAP-甲基化敏感多态性扩增技术
限制性内切酶的应用
• 自从I型限制酶发现以来,越来越多地受到生化学家 的青睐,因为限制酶对DNA分子具有专一性的切口, 而为人们在分子水平上切割分析、重组遗传信息 提供了重要的工具。 • (一)用于染色体DNA的分析 • 先将DNA用限制性内切酶切割成一系列片段,利用 聚丙烯酷胺或琼脂糖电泳可以轻而易举地将上述 片段分离并且通过测定它们在凝胶中的迁移速度 或直接在电镜下观察测量它们的大小。这些碎片 在整个基因组的排列次序,主要靠几种不同的限制 酶部分水解DNA,再对产物进行电泳分析。
限制性核酸内切酶
• 限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列， 并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸 二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。 • 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义 是提高自身的防御能力. • 限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源 DNA。
• 根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与 作用方式，可将限制酶分为三种类型，分 别是第一型（Type I）、第二型（Type II） 及第三型（Type III）。Ⅰ型限制性内切酶 既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲 基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶 只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性 内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。
• (三)基因的甲基化研究 • 由于HPal仅能识别切割双链DNA分子中ccGG顺序,但其中Cyt必需是 设有甲基化的;而MPsI识别同样的顺序,但其中Cyt必需是被甲基化的。 因此有人利用这一对限制酶对真核基因的甲基化程度进行研究(1〕。 • (四）应用于DNA重组 • 分子生物学研究中发现的许多核酸酶类都可用作基因工程的工具。其 中能识别特定的回文序列并切割DNA双链的Ⅱ类限制性核酸内切酶在 DNA重组技术中被广泛应用。 • （五）构建载体 • 采用5'端引入1个限制性内切酶Xcm Ⅰ酶切位点的1对引物,以水稻品 种日本晴基凶组DNA作为模板,扩增得到一段627 bp的PCR片段.并将 其连接到pGEM-T Easy载体上得到名为T-xia的重组载体.利用限制性 内切酶Xcm Ⅰ酶切T-xia载体产生的自制T载体与其他PCR片段连接, 检测结果表明,有80%的重组菌能扩增出目的片段。
• 质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行 人工构建的。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或 一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个 人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点 序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少， 以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅 助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克 隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序 列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个 理想的克隆载体大致应有下列一些特性：⑴分子量小、多 拷贝、松弛控制型；⑵具有多种常用的限制性内切酶的单 切点；⑶能插入较大的外源DNA片段；⑷具有两个以上的 遗传标记物，便于鉴定和筛选。⑸对宿主细胞无害。常用 的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、 PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。
应用实例 -1
• 将水稻叶绿体的DNA，用EcoRI核酸限制性内切酶消化之 后，放入含有溴化乙锭的低熔点（LMP）的1%琼脂糖凝 胶中作电泳分离。从LMP中分离出分子大小为1.8～2.5kb 之间的DNA片段，再与同样经过了EcoRI核酸限制性内切 酶切割并用碱性磷酸酶作了脱磷酸处理的pBR322质粒连 接。然后，将混合物转化到大肠杆菌5346菌株，培养在氨 苄青霉素选择平板上，形成Ampr转化子菌落群体。这样 就构成了由EcoRI核酸限制性内切酶切割的水稻叶绿体 DNA基因组库。用Ampr转化子菌落与32P放射性标记的 玉米psbA DNA 探针作菌落杂交，可以分离出其中的阳性 克隆体。从这些阳性克隆体中分离出来的重组体质粒DNA， 经过进一步的分析，就能测出水稻叶绿体基因psbA的序 列。
质粒图谱
大肠杆菌质粒的分子结构示意图
pBR322质粒
• pBR322质粒DNA分子的长度为4361bp*（*Sequencing data from Watson (confirmed at New England Biolabs, Inc.) has shown pBR322 to be 4,361 base pairs, not 4,363 base pairs as previously reported.），此载体中有 两个标记基因，一个是氨苄青霉素抗性基因（Apr），另 一个是四环素抗性基因（Tetr）。已知pBR322DNA分子 共有24种核酸内切限制酶的单一识别位点。其中7种限制 酶（从12：00位置按顺时针方向）即EcoRV、NheI、 BamHI、SphI、SalI、XmaⅢ和NruI的识别位点位于四环 素抗性基因内部，另外有2 种限制酶即ClaI和HindⅢ的识 别位点是存在于这个基因的启动区内，在这9个限制位点 上插入外源DNA都会导致tetr的失活。3种限制酶即ScaI、 PvuI和PstI的识别位点位于氨苄青霉素抗性基因内，在这 些位点插入外源DNA实际就是限制酶降解外源DNA[1] ，维护宿主遗 传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌 呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保护。通过甲基化作用达到 识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。所以，能产生 防御病毒侵染的限制酶的细菌，其自身的基因组中可能有 该酶识别的序列，只是该识别序列或酶切位点被甲基化了。 但并不是说一旦甲基化了，所有限制酶都不能切割。大多 数限制酶对DNA甲基化敏感，因此当限制酶目标序列与甲 基化位点重叠时，对酶切的影响有3种可能，即不影响、 部分影响、完全阻止。对甲基化DNA的切割能力是限制酶 内在和不可预测的特性，因此，为有效的切割DNA，必须 同时考虑DNA甲基化和限制酶对该类型甲基化的敏感性。 另外，大部分商业限制酶如今专门用于切割甲基化DNA。
• 由pBR322质粒载体的结构可知其具有如下优点：⑴具有 较小的分子量。经验表明，为了避免在DNA的纯化过程中 发生链的断裂，克隆载体的分子大小最好不要超过10Kb。 pBR322质粒这种小分子量的特点，不仅易于自身DNA的 纯化，而且可容纳较大的外源DNA片段；⑵具有两种抗菌 素抗性基因可供作转化子的选择记号，能指示载体或重组 DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载 体分子形成了重组子。标记基因往往可以赋予宿主细胞一 种新的表型，这种转化细胞可明显地区别于非转化细胞。 当我们把一个DNA片段插入到某一个标记基因内时，该基 因就失去了相应的功能。当把这种重组DNA分子转到宿主 细胞后，该基因原来赋予的表型也就消失了。要是仍保留 了原来表型的转化细胞，细胞内含有的DNA分子一定不是 重组子。很显然，既要指示外源DNA是否进入了宿主细胞， 又要指示载体DNA分子中是否插入了外源DNA片段，那么 这种载体必须至少具有两个标记基因。另外，pBR322质 粒载体还具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每 个细胞中可积累1000~3000个拷贝，这就为重组体DNA的 制备提供了极大的方便。
细胞复制
• 质粒在细胞内的复制一般有两种类型：紧密控制 型（Stringent control）和松弛控制型（Relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复 制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每 个细胞内只含有一个或几个质粒分子，如F因子。 后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在 每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，如 Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时， 细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂 均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松弛型质 粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至 1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可 由原来的2%增加至40-50%。
• 常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pBR322含 有抗四环素基因（Tcr）和抗氨苄青霉素基因（Apr），并 含有27种限制性内切酶的单一识别位点。 • pBR322质粒作为一种常用的基因克隆载体，在实际应用 中有着非常重要的地位，其中一个突出的例子就是应用 pBR322 作为克隆载体对水稻的叶绿体光诱导基因psbA 进行结构分析。
限制酶的作用位点
质粒
• 质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细 胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。 • 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术， 送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体 （Vector）。细菌质粒是重组DNA 技术中常用的 载体。质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。 质粒还带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞 一些遗传性状。其自我复制能力及所携带的遗传 信息在重组DNA操作，如扩增、筛选过程中都是 极为有用的。