蛋白质的修饰和表达精品课件
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具有突变率高、简单易行、重复性好的特 点。
野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）在紫外光 激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对 其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现 在的GFP能在可见光的波长范围被激发，而 且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现 了绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白等。
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32
1、重叠延伸PCR技术
因为任何给定的氨基酸残基在蛋白质分子中可能出现不止 一次，如果用化学的方法对氨基酸进行修饰时，正常情况 下所有相关的氨基酸侧链都要被取代。至于谈到氨基和羧 基基团，尽管处在侧链上和末端基团的pK值有差别，但在 化学上很难将肽链的-氨基或-羧基基团与侧链上的氨基 或羧基相区别。
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4
Fra Baidu bibliotek
蛋白质侧链的化学修饰是通过选择性试剂 或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定 的功能基团发生化学反应而实现的。
蛋白质的修饰和表达是蛋白质工程的重要 研究内容和手段。将从蛋白质修饰的化学 途径、蛋白质改造的分子生物学途径和重 组蛋白质的表达进行讲解。
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1
第一节 蛋白质修饰的化学途径
蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引 入或去除，而使蛋白质的一级结构发生改 变的过程。
有些情况下，化学结构的改变并不影响蛋 白质的生物学活性，这些修饰称为非必需 部分的修饰。但多数情况下，蛋白质结构 的改变将导致生物活性的改变。
关键在于选择适当的突变频率。一般目标 基因内有1.5-5个碱基发生碱基替换时，诱变 结果最理想。
由于一轮易错PCR往往很难获得满意的结果， 因此常用连续易错PCR方法。
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38
DNA shuffling allows accelerated evolution of genes
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再用DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来 源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对 DpnI敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的 质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的 转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
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36
（二）定向进化
在实验室中模仿自然进化的关键步骤—突变、重 组和筛选，在较短的时间内完成漫长的自然进化 过程，有效的改造蛋白质，使之适于人类的需 要。，这种策略只针对特定蛋白质的特定性质， 因而被称为定向进化。
39
2、筛选
（1）表型观察选择和筛选 菌落分泌的蛋白酶可在含酪蛋白的琼脂平
板上产生清晰的水解圈。
在高温并有蓝色木聚糖底物存在的条件下， 根据菌落周围地物的颜色变化来筛选耐高 温的木聚糖酶。
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40
（2）高通量筛选方法
噬菌体展示技术、细菌展示技术、酵母菌 展示技术、核糖体展示技术、酵母双杂交 系统等。
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6
5，5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）是目前
最常用的巯基修饰试剂之一，可与巯基反 应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放一个 有颜色的TNB阴离子，该离子在412nm有很
强的吸收，可以通过光吸收变化来检测反 应程度。
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7
（二）氨基的化学修饰
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25
酶的固定化可通过吸附法、交联法、包埋 法、共价结合法去实现。
1、交联法
是利用双功能或多功能试剂在酶分子间、 酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进 行交联反应，把酶分子彼此交叉连接起来， 形成网络结构的固定化酶。
常用的交联剂是戊二醛和双重氮联苯胺 -2， 2-二磺酸。
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35
2、快速定点突变 首先准备质粒：必须是从常规E.coli中经纯化试剂
盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。 然后，设计一对包含突变位点的引物（正、反
向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循 环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版 延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反 复加热褪火延伸的循环。)正反向引物的延伸产物 退火后配对成为带缺刻的开环质粒。
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14
5、蛋氨酸主要是由于硫醚的硫原子的亲核 性所引起的，一些氧化剂可以使蛋氨酸氧 化。
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15
二、蛋白质的位点专一性修饰
专一性包括两方面的含义：一是试剂对被 修饰基团的专一性；二是试剂对蛋白质分 子中被修饰部位，如膜蛋白质上的激素结 合部位、酶的活性部位等位点的专一性， 一般这类试剂不仅具有对被作用基团的专 一性，而且具有对被作用部位的专一性。 这类专一性的化学修饰，称为亲和标记或 专一性的不可逆抑制作用。这类修饰试剂 也被称为位点专一性抑制剂。
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18
另一类是Kcat型的不可逆抑制剂，是根据酶 催化过程设计的。这类抑制剂具有和底物 类似的结构，具有被酶催化和结合的性质。 此外还有一个潜伏反应基团，在酶对它进 行催化反应时，这个潜伏基团被酶催化而 活化，对活性部位起不可逆抑制作用。这 类抑制剂的专一性很高，被称为“自杀性 底物”。
2）反应必须在温和pH、中度离子强度和低 温缓冲液中进行
3）所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的 其他功能基团副反应尽可能少
4）要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少 载体的空间位阻对酶活力的影响。
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29
第二节 蛋白质的分子生物学改造
蛋白质的分子生物学改造主要有基因突变、 基因融合和掺入非天然氨基酸等方法。
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12
3、精氨酸残基含一个胍基，精氨酸残基的 强碱性，使其很难与大多数试剂发生修饰 反应，但可以和二羰基化合物发生反应。
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13
4、色氨酸吲哚基可以发生取代反应或者被 氧化裂解。N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）可以 使吲哚基团氧化成羟吲哚衍生物，但专一
性较差，酪氨酸残基也可与该试剂发生反 应。
还可以保护蛋白质不易被蛋白酶水解。
修饰后，分子量增加，肾小球滤过减少。
这些均有助于蛋白质类药物循环半衰期的 延长。
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22
修饰时，先对PEG进行活化，活化的PEG 可与蛋白质分子侧链上的各种化学基团反
应而与蛋白质相偶联，蛋白质分子上与 PEG进行偶联的基团主要是氨基、巯基和 羧基。
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19
（二）光亲和标记
这类试剂在结构上除了有一般亲和试剂的 特点外，还具有一个光反应基团。
反应一般分两步进行：第一步，试剂先与 蛋白质的活性部位在暗条件下发生特异性 结合；第二步，光照，试剂被光激活后， 产生一个高度活泼的功能基团，与活性部 位的侧链基团发生反应。
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20
三、蛋白质的聚乙二醇修饰
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24
蛋白质分子的固定化
蛋白质分子的固定主要是酶分子的固定。 酶的固定化，使用固体材料将酶束缚或限制于一
定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应，并可 回收及重复使用的一类技术。 优点：1、既能保持酶的活性又能克服游离酶的一 些不足，提高酶分子的稳定性。 2、能与产物分开，有效地控制生产过程 3、能与产物分开，可省去热处理使酶失活的步骤， 简化生产工艺 4、酶可在生产中重复利用，提高了酶的利用率。
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2
影响化学修饰的主要因素有两方面：
1、蛋白质功能基的活性反应，包括基团之 间的氢键和静电作用等，基团之间的的空 间阻力。
2、修饰剂的反应活性。
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3
一、蛋白质侧链的化学修饰
在20种天然氨基酸的侧链中，大约有一半可以在足够温和 的条件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、巯基 和羧基特别容易产生有用的取代。
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27
2、共价结合法
是酶蛋白分子上功能团和固定支持物表面 上的反应基团之间形成化学共价键连接， 以固定酶的方法。
常用载体为：天然高分子（纤维素、琼脂 糖、淀粉等），合成高聚物（尼龙、多聚 氨基酸），无机支持物（多孔玻璃）
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28
影响因素：1）要求载体亲水，并且有一定 的机械强度和稳定性，同时具备在温和条 件下与酶结合的功能基团
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30
一、基因突变技术
基因突变技术是通过在基因水平上对其编 码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用 来研究蛋白质结构功能的一种方法。
根据改造策略的不同可以分为定点突变和 定向进化两种，前者属于理性的设计方法， 后者属于非理性的设计方法。
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31
（一）定点突变
对已知基因的特定碱基进行定点改变、缺 失或者插入。
需要两项支撑技术，一是产生大量突变体为进一 步筛选提供丰富的素材；二是有合适的筛选系统， 可迅速从突变题库中筛选到符合目标的蛋白质。
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37
1、制造突变体
（1）易错PCR 基本原理是通过改变正常PCR反应体系中某
些组分的数量或质量，随机引入错误碱基 从而创造序列多样性的DNA序列文库。
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16
（一）亲和标记
亲和标记是一类位点专一性的化学修饰， 试剂可以专一性标记于酶的活性部位上， 使酶不可逆的失活，因此又称为专一性的 不可逆抑制作用。
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17
这类抑制剂可分为两类：
一类是Ks型的不可逆抑制剂，它是根据底 物的结构设计的，它具有和底物结构相似 的结合集团，同时还具有和活性部位氨基 酸残基的侧链基团反应的活性基团。
聚乙二醇（PEG）由环氧乙烷聚合而成， 两端各有一个羟基，若一端以甲基封闭则 得到单甲氧基聚乙二醇（mPEG）。蛋白质 修饰中应用最多的是mPEG的衍生物。
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21
PEG与蛋白质的非必需基团共价结合时， 可作为一种屏障挡住蛋白质分子表面的抗 原决定簇，避免抗体产生，或者阻止抗原 与抗体的结合而抑制免疫反应的发生。
由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物 形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中 通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片 段重叠拼接起来。
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33
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34
为提高葡萄糖异构酶的热稳定性，用双引
物法对葡萄糖异构酶基因进行了体外定点 突变，以Pro138替代Gly138，突变性葡萄糖 异构酶的热半衰期比野生型涨一倍，最是 反应温度提高10-12度。
赖氨酸的ε-氨基是蛋白质分子中亲核反应 活性很高的基团，是蛋白质或多肽分子比 较容易与修饰剂发生作用的位点。
常见的修饰剂有三硝基苯磺酸、烷基化试 剂、氰酸盐以及盐酸吡哆醛等。
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8
（三）羧基的化学修饰 谷氨酸、天冬氨酸
修饰方法很有限，产物一般是脂类或酰胺 类。
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9
（四）二硫键的化学修饰
26
交联法有四种形式：1）酶直接交联法：在 酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不 溶性衍生物。2）酶辅助蛋白交联法：酶量 有限时，使酶与惰性蛋白共交联的方法。3） 吸附交联法：先将 酶吸附在硅胶、皂土、
氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子 交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交 联。4）载体交联法：用多功能试剂的一部 分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中 的另一部分功能集团偶联酶蛋白。
一般用变性剂如巯基乙醇，将二硫键还原 成游离的巯基，再通过巯基修饰的方法对 其进行修饰，如经过羧甲基化处理，以防 止重新氧化成二硫键。
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10
（五）其他侧链基团的修饰
1、组氨酸残基的咪唑基可以通过氮原子的 烷基化或碳原子的亲核取代来进行修饰。
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11
2、酪氨酸残基的修饰既可以是酚羟基的修 饰，也可以是芳香环上的取代反应。
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41
噬菌体展示技术
是一种将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣 壳蛋白融合并展示于噬菌体表面的技术。
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23
四、蛋白质的化学交联和化学偶联
化学交联可以发生于分子内的亚基与亚基 之间，也可以发生与蛋白质分子与分子之 间，也可以发生于蛋白质分子与分子之间， 也可发生于多个分子之间，而形成网状交 联。交联剂为含有双功能基团的化学试剂。 如戊二醛
蛋白质的化学偶联是指将蛋白质分子偶联 到一个化学惰性的水不溶性载体上，形成 固定化蛋白质。
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5
（一）巯基的化学修饰
由于巯基有很强的亲核性，巯基基团一般 是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。
烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂， 特别是碘乙酸和碘乙酰胺。氨基酸测序前， 常用碘乙酸来使巯基基团羧甲基化，以防 止半胱氨酸的降解。
其他一些卤代酸、卤代酰胺也可以修饰巯 基。
N-乙基马来酰亚胺也是一种有效的巯基修 饰试剂，该反应具有较强的专一性并伴随 光吸收的变化。
野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）在紫外光 激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对 其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现 在的GFP能在可见光的波长范围被激发，而 且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现 了绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白等。
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32
1、重叠延伸PCR技术
因为任何给定的氨基酸残基在蛋白质分子中可能出现不止 一次，如果用化学的方法对氨基酸进行修饰时，正常情况 下所有相关的氨基酸侧链都要被取代。至于谈到氨基和羧 基基团，尽管处在侧链上和末端基团的pK值有差别，但在 化学上很难将肽链的-氨基或-羧基基团与侧链上的氨基 或羧基相区别。
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蛋白质侧链的化学修饰是通过选择性试剂 或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定 的功能基团发生化学反应而实现的。
蛋白质的修饰和表达是蛋白质工程的重要 研究内容和手段。将从蛋白质修饰的化学 途径、蛋白质改造的分子生物学途径和重 组蛋白质的表达进行讲解。
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1
第一节 蛋白质修饰的化学途径
蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引 入或去除，而使蛋白质的一级结构发生改 变的过程。
有些情况下，化学结构的改变并不影响蛋 白质的生物学活性，这些修饰称为非必需 部分的修饰。但多数情况下，蛋白质结构 的改变将导致生物活性的改变。
关键在于选择适当的突变频率。一般目标 基因内有1.5-5个碱基发生碱基替换时，诱变 结果最理想。
由于一轮易错PCR往往很难获得满意的结果， 因此常用连续易错PCR方法。
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38
DNA shuffling allows accelerated evolution of genes
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再用DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来 源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对 DpnI敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的 质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的 转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
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36
（二）定向进化
在实验室中模仿自然进化的关键步骤—突变、重 组和筛选，在较短的时间内完成漫长的自然进化 过程，有效的改造蛋白质，使之适于人类的需 要。，这种策略只针对特定蛋白质的特定性质， 因而被称为定向进化。
39
2、筛选
（1）表型观察选择和筛选 菌落分泌的蛋白酶可在含酪蛋白的琼脂平
板上产生清晰的水解圈。
在高温并有蓝色木聚糖底物存在的条件下， 根据菌落周围地物的颜色变化来筛选耐高 温的木聚糖酶。
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（2）高通量筛选方法
噬菌体展示技术、细菌展示技术、酵母菌 展示技术、核糖体展示技术、酵母双杂交 系统等。
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6
5，5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）是目前
最常用的巯基修饰试剂之一，可与巯基反 应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放一个 有颜色的TNB阴离子，该离子在412nm有很
强的吸收，可以通过光吸收变化来检测反 应程度。
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（二）氨基的化学修饰
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酶的固定化可通过吸附法、交联法、包埋 法、共价结合法去实现。
1、交联法
是利用双功能或多功能试剂在酶分子间、 酶分子与惰性蛋白间或酶分子与载体间进 行交联反应，把酶分子彼此交叉连接起来， 形成网络结构的固定化酶。
常用的交联剂是戊二醛和双重氮联苯胺 -2， 2-二磺酸。
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2、快速定点突变 首先准备质粒：必须是从常规E.coli中经纯化试剂
盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。 然后，设计一对包含突变位点的引物（正、反
向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循 环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版 延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反 复加热褪火延伸的循环。)正反向引物的延伸产物 退火后配对成为带缺刻的开环质粒。
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5、蛋氨酸主要是由于硫醚的硫原子的亲核 性所引起的，一些氧化剂可以使蛋氨酸氧 化。
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二、蛋白质的位点专一性修饰
专一性包括两方面的含义：一是试剂对被 修饰基团的专一性；二是试剂对蛋白质分 子中被修饰部位，如膜蛋白质上的激素结 合部位、酶的活性部位等位点的专一性， 一般这类试剂不仅具有对被作用基团的专 一性，而且具有对被作用部位的专一性。 这类专一性的化学修饰，称为亲和标记或 专一性的不可逆抑制作用。这类修饰试剂 也被称为位点专一性抑制剂。
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18
另一类是Kcat型的不可逆抑制剂，是根据酶 催化过程设计的。这类抑制剂具有和底物 类似的结构，具有被酶催化和结合的性质。 此外还有一个潜伏反应基团，在酶对它进 行催化反应时，这个潜伏基团被酶催化而 活化，对活性部位起不可逆抑制作用。这 类抑制剂的专一性很高，被称为“自杀性 底物”。
2）反应必须在温和pH、中度离子强度和低 温缓冲液中进行
3）所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的 其他功能基团副反应尽可能少
4）要考虑到酶固定化后的构型，尽量减少 载体的空间位阻对酶活力的影响。
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第二节 蛋白质的分子生物学改造
蛋白质的分子生物学改造主要有基因突变、 基因融合和掺入非天然氨基酸等方法。
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3、精氨酸残基含一个胍基，精氨酸残基的 强碱性，使其很难与大多数试剂发生修饰 反应，但可以和二羰基化合物发生反应。
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4、色氨酸吲哚基可以发生取代反应或者被 氧化裂解。N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）可以 使吲哚基团氧化成羟吲哚衍生物，但专一
性较差，酪氨酸残基也可与该试剂发生反 应。
还可以保护蛋白质不易被蛋白酶水解。
修饰后，分子量增加，肾小球滤过减少。
这些均有助于蛋白质类药物循环半衰期的 延长。
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22
修饰时，先对PEG进行活化，活化的PEG 可与蛋白质分子侧链上的各种化学基团反
应而与蛋白质相偶联，蛋白质分子上与 PEG进行偶联的基团主要是氨基、巯基和 羧基。
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19
（二）光亲和标记
这类试剂在结构上除了有一般亲和试剂的 特点外，还具有一个光反应基团。
反应一般分两步进行：第一步，试剂先与 蛋白质的活性部位在暗条件下发生特异性 结合；第二步，光照，试剂被光激活后， 产生一个高度活泼的功能基团，与活性部 位的侧链基团发生反应。
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三、蛋白质的聚乙二醇修饰
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蛋白质分子的固定化
蛋白质分子的固定主要是酶分子的固定。 酶的固定化，使用固体材料将酶束缚或限制于一
定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应，并可 回收及重复使用的一类技术。 优点：1、既能保持酶的活性又能克服游离酶的一 些不足，提高酶分子的稳定性。 2、能与产物分开，有效地控制生产过程 3、能与产物分开，可省去热处理使酶失活的步骤， 简化生产工艺 4、酶可在生产中重复利用，提高了酶的利用率。
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影响化学修饰的主要因素有两方面：
1、蛋白质功能基的活性反应，包括基团之 间的氢键和静电作用等，基团之间的的空 间阻力。
2、修饰剂的反应活性。
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一、蛋白质侧链的化学修饰
在20种天然氨基酸的侧链中，大约有一半可以在足够温和 的条件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、巯基 和羧基特别容易产生有用的取代。
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2、共价结合法
是酶蛋白分子上功能团和固定支持物表面 上的反应基团之间形成化学共价键连接， 以固定酶的方法。
常用载体为：天然高分子（纤维素、琼脂 糖、淀粉等），合成高聚物（尼龙、多聚 氨基酸），无机支持物（多孔玻璃）
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影响因素：1）要求载体亲水，并且有一定 的机械强度和稳定性，同时具备在温和条 件下与酶结合的功能基团
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一、基因突变技术
基因突变技术是通过在基因水平上对其编 码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用 来研究蛋白质结构功能的一种方法。
根据改造策略的不同可以分为定点突变和 定向进化两种，前者属于理性的设计方法， 后者属于非理性的设计方法。
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（一）定点突变
对已知基因的特定碱基进行定点改变、缺 失或者插入。
需要两项支撑技术，一是产生大量突变体为进一 步筛选提供丰富的素材；二是有合适的筛选系统， 可迅速从突变题库中筛选到符合目标的蛋白质。
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1、制造突变体
（1）易错PCR 基本原理是通过改变正常PCR反应体系中某
些组分的数量或质量，随机引入错误碱基 从而创造序列多样性的DNA序列文库。
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（一）亲和标记
亲和标记是一类位点专一性的化学修饰， 试剂可以专一性标记于酶的活性部位上， 使酶不可逆的失活，因此又称为专一性的 不可逆抑制作用。
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这类抑制剂可分为两类：
一类是Ks型的不可逆抑制剂，它是根据底 物的结构设计的，它具有和底物结构相似 的结合集团，同时还具有和活性部位氨基 酸残基的侧链基团反应的活性基团。
聚乙二醇（PEG）由环氧乙烷聚合而成， 两端各有一个羟基，若一端以甲基封闭则 得到单甲氧基聚乙二醇（mPEG）。蛋白质 修饰中应用最多的是mPEG的衍生物。
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PEG与蛋白质的非必需基团共价结合时， 可作为一种屏障挡住蛋白质分子表面的抗 原决定簇，避免抗体产生，或者阻止抗原 与抗体的结合而抑制免疫反应的发生。
由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物 形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中 通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片 段重叠拼接起来。
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为提高葡萄糖异构酶的热稳定性，用双引
物法对葡萄糖异构酶基因进行了体外定点 突变，以Pro138替代Gly138，突变性葡萄糖 异构酶的热半衰期比野生型涨一倍，最是 反应温度提高10-12度。
赖氨酸的ε-氨基是蛋白质分子中亲核反应 活性很高的基团，是蛋白质或多肽分子比 较容易与修饰剂发生作用的位点。
常见的修饰剂有三硝基苯磺酸、烷基化试 剂、氰酸盐以及盐酸吡哆醛等。
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（三）羧基的化学修饰 谷氨酸、天冬氨酸
修饰方法很有限，产物一般是脂类或酰胺 类。
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（四）二硫键的化学修饰
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交联法有四种形式：1）酶直接交联法：在 酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不 溶性衍生物。2）酶辅助蛋白交联法：酶量 有限时，使酶与惰性蛋白共交联的方法。3） 吸附交联法：先将 酶吸附在硅胶、皂土、
氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子 交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交 联。4）载体交联法：用多功能试剂的一部 分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中 的另一部分功能集团偶联酶蛋白。
一般用变性剂如巯基乙醇，将二硫键还原 成游离的巯基，再通过巯基修饰的方法对 其进行修饰，如经过羧甲基化处理，以防 止重新氧化成二硫键。
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（五）其他侧链基团的修饰
1、组氨酸残基的咪唑基可以通过氮原子的 烷基化或碳原子的亲核取代来进行修饰。
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2、酪氨酸残基的修饰既可以是酚羟基的修 饰，也可以是芳香环上的取代反应。
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噬菌体展示技术
是一种将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣 壳蛋白融合并展示于噬菌体表面的技术。
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四、蛋白质的化学交联和化学偶联
化学交联可以发生于分子内的亚基与亚基 之间，也可以发生与蛋白质分子与分子之 间，也可以发生于蛋白质分子与分子之间， 也可发生于多个分子之间，而形成网状交 联。交联剂为含有双功能基团的化学试剂。 如戊二醛
蛋白质的化学偶联是指将蛋白质分子偶联 到一个化学惰性的水不溶性载体上，形成 固定化蛋白质。
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5
（一）巯基的化学修饰
由于巯基有很强的亲核性，巯基基团一般 是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。
烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂， 特别是碘乙酸和碘乙酰胺。氨基酸测序前， 常用碘乙酸来使巯基基团羧甲基化，以防 止半胱氨酸的降解。
其他一些卤代酸、卤代酰胺也可以修饰巯 基。
N-乙基马来酰亚胺也是一种有效的巯基修 饰试剂，该反应具有较强的专一性并伴随 光吸收的变化。