实验 酵母菌形态学观察与显微镜直接计数技术1

四、实验方法
五）点植法接种霉菌 融化马丁氏培养基，倾倒平板。冷凝。 无菌接种法点植霉菌，每个平板点植4点。 每种霉菌只能点植在同一个平板上。 每1组1板，每人点植1点。 1/3组点植青霉菌 1/3组点植曲霉 1/3组点植 根霉
四、实验方法

六
）芽孢杆菌的保存和验证
-观察抑菌圈大小

二、实验内容
I. 酵母形态观察

1.肉眼观察酵母菌苔，了解酵母菌培养特性 2.显微镜下观察酵母个体，认识酵母细胞形态：酵母单细胞、牙殖子、 子囊孢子染色和假菌丝。 1. 用目镜测微尺和物镜测微尺，标定，测定酵母细胞大小。
II. 测微技术和计数
2.用血球计数板用酵母菌悬液进行计数，学习直接计数法。
四、实验方法
三）计数技术：
计数过程及原则：

(1)准备：镜检计数室，熟悉其结构；样品稀释（目的是便于 酵母菌悬液的计数）.

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(2）将血球计数板用擦镜纸擦净或吹干,在计数室上加盖玻片.
(3）将提供的稀释10倍的酵母菌悬液混匀,用吸管尽可能快地 吸取一滴置于盖玻片的边缘,使菌液缓缓渗入,静置5min以上， 使酵母菌全部沉降到血球计数室内. (4)计数时,如果使用16中格×25小格规格的计数室,取对角线顶 位（左上,右上,左下,右下）4个中格的酵母菌数.如果规格为25 中格×16小格的计数板,除取其4个对角位外,还需再数中央的一 个中格的酵母菌数.对每个样品计数三次,取其平均值,取均值。
实验四 酵母菌形态观察、测微 技术、细胞计数、不同 接种技术、抑菌能力观 察
目的要求 内容
原理
方法
结果与分析
一、目的要求
1.观察酵母菌的不同细胞形态（单细胞和假丝） 2.观察酵母菌的繁殖方式(出芽\子囊），学习区 别死活细胞的染色方法 3.学习测微技术 4.学习直接计数的方法。 5.学习插片法培养放线菌和点植法培养霉菌。 6.观察土壤芽孢杆菌抗霉菌、抗葡萄球菌能力。
酵母菌的有性生殖方式,是指邻 近两个”性别”不同的细胞,相 互接触,局部融合,再通过质配, 核配和减数分裂,形成4个单倍 体子核,每一个子核与其附近的 原生质一起,在其表面形成一层 孢子壁后,就形成了一个子囊孢 子,而原有营养细胞就成了子囊
BW
3.酵母菌的形态有何特点？
大多数酵母菌为单细胞，形状因种 而异。基本形态为球形、卵圆形、 圆柱形或香肠形。有些 酵母菌(热 带假丝酵母，Candida tropicalis) 进行一连串的芽殖后，长大的子细 胞与母细胞并不立即分离，其间仅 以狭小的接触面相连，这种藕节状 的细胞串称为“假菌丝” (图)。 （如果细胞相连，且其间的横截面 积与细胞直径一致，这种竹节状的 细胞串称真菌丝。如霉菌菌丝等）。 BW
子囊孢子染色


孢子壁厚不易着色，但是一旦着色就很难 被脱色。因此先用强染色剂（孔雀绿）下 染色，使染料进入菌体和孢子，水洗时菌 体中染色被洗脱而孢子中染料保留。在用 对比度大的复染色剂染色后，菌体染上复 染色剂的颜色而孢子保留原来颜色，这样 可将两者区别开来。 制片，取在28℃培养7d斜面培养物涂片， 并干燥固定 孔雀绿染2min,水洗，95%乙醇脱色，番红 染1min,水洗干燥，
总菌计数：显微计数法。适用于各种含单细胞菌 体的纯培养悬浮液。菌体较大的酵母菌或霉菌孢 子可采用血球计数板，一般细菌则采用细菌计数 板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计 数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较 厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。
显微镜计数技术
血球计数板是一 块特制的厚型载 玻片，载玻片上 有4条槽而构成 3个平台。中间 的平台较宽，其 中间又被一短横 槽分隔成两半， 每个半边上面各 有一个计数区 （图5-2）。

四、实验方法

三）计数技术：

(5)当细胞位于中格线上，采用“上计下不计，左计右 不计”原则. (6)遇到有芽体的酵母时，若芽体≥1/2母体，认为芽体 =1。


（7）按照以上各均值，计算每1ml菌液中所含的酵母 菌个数.
（8）血球计数板的清洁：血球汁数板使用后,用自来 水冲洗,切勿用硬物洗刷,洗后自行晾干或用吹风机吹干, 或用95%的乙醇,无水乙醇等有机溶剂脱水使其干燥.通 过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物.若不 干净,则必须重复清洗直到完全洁净为止.
四、实验方法
一）酵母菌形态观察： (1)酵母菌菌落观察：观察菌落表面干燥或润湿、 隆起形状、边缘整齐度、大小、颜色等，并用接 种环挑菌，注意与培养基结合是否紧密。 (2)个体形态观察：用美兰浸片观察啤酒酵母菌/红 酵母的基本细胞形态、芽殖子、区别死活细胞。 方法：在载玻片中央加一滴美兰溶液，取少量啤 酒酵母置于其中，使菌体与染色液混合均匀，将 盖片斜置，慢慢放下盖在液滴上，以免产生气泡。 用高倍镜观察（不用油镜）即可。 （3）假丝酵母假菌丝的观察：用水浸片观察假丝 酵母的假菌丝。
-保存菌种 -重复实验
五、结果与讨论

1.绘图说明酵母菌各形态观察结果。 2.列表记录各计数原始值，依此计算所提供菌悬液中 酵母菌的浓度。 3.你每次取样的计数结果差异大吗？如果比较大，试 分析原因。
示 教
测微尺安装、酵母计数过程
The End
III. 实验准备

1.高氏1号培养基融化倾倒，用活化的放线菌，学习放线菌的插片接种 法，每2组一板。 2. 马丁培养基倾倒，1组1板，用活化的一种霉菌点植接种青霉菌，曲 霉和根霉。 3.观察土壤芽孢杆菌抑菌能力。
三、实验原理
1.
如何区别酵母菌细胞的死活？ 其原理如何？ 2.酵母菌的生殖方式有哪些？ 3.酵母菌的形态有何特点？ 4.测微技术原理 5.血球计数板的构造及用其进行 微生物直接计数的原理？
四、实验方法

二）测微技术

1、取下接目镜，旋下目镜上的目透镜，将目镜测微尺 放入接目镜的中隔板上，使有刻度一面朝下，再旋上 目透镜，装入镜筒内。 2、将物镜测微尺置于显微镜的载物台上，使有刻度的 一面朝上，同观察标本一样，使具有刻度的小圆圈位 于视野中央。

3、目镜测微尺刻度的标定 4、记录二条重合线间的目镜测微尺的格数和物镜测微 尺的格数。计算目镜测微尺的刻度。 5、酵母水浸片的制备观察、测大小。
显微镜计数技术
计数区的刻度有两种：一种 是计数区分9个大方格（大 方格用三线隔开），而每个 大方格又分成16个中方格； 另一种是一个计数区分成 25个中方格（大方格之间 用双线分开）。但是不管计 数区是哪一种构造，它们都 有一个共同特点，即计数区 都由400个小方格组成。
显微镜计数技术


计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2 盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区 的体积为0.1mm3。 使用血球计数板计数时，先要测定每个中方格中微生物 的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细 胞的数量。计算公式： (1)16中格×25小格的血球计数板计算公式: 细胞数/ml=每中格内细胞个数×16×104×稀释倍数 (2)25格x16格的血球计数板计算公式: 细胞数/ml=每中格内细胞个数×25×104×稀释倍数

先用低倍镜观察，对准焦距，待看清物镜测微 尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度 与物镜测微尺的刻度相平行，并使两尺的左边 第一条线相重合，再向右寻找两尺的另外一条 重合线。

目镜测微尺每格长度=两个重叠刻度间物镜测 微尺格数×10/两个重叠刻度间目镜测微尺格 数。
5、显微镜计数技术

活菌计数法：平板菌落计数法。通过培养活菌， 形成菌落而计数。
当加入美兰液后，就被美兰液染成兰色。进而达到 鉴别的目的。
必须指出，上述鉴别法中酵母细胞的颜色往往会受
到美兰液的浓度、作用时间的影响，实际应用操作 中应十分注意。 BW
2.酵母菌的生殖方式有哪些？
1.无性生殖
芽殖酵母的种类多，主要是通 过出芽的方式进行无性生殖.裂 殖酵母菌通过与细菌相似的裂 殖方式进行无性生殖，进行裂 殖的酵母菌种类很少 。 2.有性生殖
4、测微技术

测微尺分目镜测微尺和物镜测微尺。


目镜测微尺是一块圆形玻片，刻度随着使用的目镜和物镜 的放大倍数而改变,用前必须用物镜测微尺来标定。
物镜测微尺为一块特制的载玻片，其中央有一小圆圈。圆 圈内刻有分度，将长1mm的直线等分为100小格，每小格 等于10μm。
物镜测微尺
目镜测微尺
测微技术-标定
三、实验原理
1.用什么方法区别酵母菌死活细胞？其原理如何？
常用区别酵母细胞死与活的方法，是采用0.1％的
吕氏美兰液染色法。
活的酵母细胞由于不停地进行新陈代谢，细胞内氧
化还原值颇小，还原力强，美兰染液进入细胞后， 能立即还原脱色，不能被美兰液染上颜色；
而死后或接近死亡的酵母细胞，不具有此还原能力，
四、实验方法
四）插片接种法 融化高氏1号培养基，倾倒平板。冷凝。 将浸泡于酒精中的盖玻片用酒精燃烧法灭菌、 冷却，45度倾角插入培养基。 接种环取放线菌孢子，沿插片接缝处划线接种。 每人练习1片，共用培养基。 每2组共用一平板。每板插片4片 一半同学接种天蓝色放线菌，另一半同学接种 白色放线菌