等 电 聚 焦 电 泳
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电泳仪 凝胶玻管 三角烧杯 10cm长针头
实用文档
52
[试剂]
分离胶缓冲液 Acr-Bis TEMED、AP Ampholine 电极缓冲液（0.2%H2SO4、2%NaOH）
实用文档
53
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
[操作]
1.凝胶的制备 2.电泳 3.剥胶 4.观察结果
实用文档
54
[思考题]
1.PAGE与IEFE有何区别？ 2.本实验的关键步骤是什么？
等电聚焦电泳
Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEFE
实用文档
1
一、IEFE 定义
IEFE 一 种 利 用 具 有 pH 梯 度 的支持介质分离等点电不同的蛋 白质的电泳技术。
实用文档
2
各种蛋白质各自都有一个等电点,在一 特殊的pH环境中,蛋白质分子呈电中性, 在电场中不会迁移。
2.电泳区带相当狭窄。 3.重复性好。
实用文档
4
（二）缺点
1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋 白质可能发生沉淀。
2.样品中的成分必须停留在其pI，不适 用 在pI不溶或发生变性的蛋白质。
实用文档
5
分辨率较不连续PAGE更高，特别 适合于分离分子量相同而电荷不同 的生物大分子。
实用文档
6
实用文档
47
实验 血红蛋白的等点聚焦电泳
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48
[原理]
Hb具有四条多肽链和球蛋白
（α、β、γ、δ）
pI
HbA α2β2 HbA2 α2δ2 HbF α2γ2 HbA3
>95% 6.87 2-3% 7.38 <2% 6.98
<6.87
实用文档
49
HbA 正常成人血中主要的Hb成分。
HbA2 正常成人Hb中的一个次要成分， 当 胎儿出生时，其浓度不到1%，以后 稍增多，在正常成人中其平均值自 2.2% 至2.6%左右，最高范围一般 不超过3.5%。
实用文档
11
进行IEFE必须具备3个条件：
①有一个在电泳条件下基本稳定、重 复性良好的pH梯度
②有一个抗对流的电泳材料，使已经 分离的样品不再重新混合
③电泳后有适当的方法来鉴定分离的 区带
实用文档
12
（一）pH梯度的建立
用多种两性电解质混合物建立稳定 良好的pH梯度
实用文档
13
1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes）应具备的特征：
加成反应
丙烯酸+多乙烯多胺
（LKB）
Ampholine
本质：一系列脂肪族多氨基多羧酸同系物 和异构体，具有很多既不相同又十分接 近相互连接的pI值。
pH范围：pH3~10
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15
实用文档
16
实用文档
17
3.pH梯度的形成
载体两性电解质是一系列不同分 子的两性电解质的混合物,在通电后， 它们各自迁移到适当位置形成一个 连续的pH梯度。
实用文档
43
等电点聚焦的分离容量受下列几个因素影响：
1、聚焦后每一区带的蛋白量取决于密度梯 度所能支持的蛋白质，提高密度可以提 高分离容量；
2、容量与区带高度的平方成正比，降低电 压可使区带变宽，提高容量，但分辨率 降低，聚焦时间长，用窄的pH梯度范围 可以使区带变宽，提高分辨率。
3、分离的容量与柱的横载面成正比，用440 毫克柱时，可加粗蛋白质5克，每一区带 可达一克。
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28
pH
ApH=p H’
+
b
实用文档
-
29
当 环 境 pI<pH’ 时 ， 它 带 正 电 荷 ， 朝负极移动，直至移动到它的等点电处， 在那里聚集。由于两性电解质A在它的pI 处具有一定的缓冲能力，因此在它附近 形成一个pH稳定区域。（图c）
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30
pH
pH=p A+ H’
+
c
实用文档
-
31
同样载体两性电解质中各种两性 电解质也会各自迁移到它们的等电点处， 由于它们的数量足够多，各自的等电点 相差很小，从而形成一个pH梯度。（图 d）
实用文档
32
pH
+
-
d
实用文档
33
假设在一个系统中含有极多的有 适当的等电点和它的等电点处有一 定的缓冲能力的两性电解质，因此 形成的pH梯度将是连续平滑的。
极反应：
正极端反应：6H2O→O2+4H3O++4e负极端反应：4H2O+4e-→2H2+4OH-
在负极引起pH值的升高，在正极 pH下降，另外在电极槽的正极端放的是 酸性溶液，负极端放的是碱性溶液造成 了在电极附近pH的急剧变化。（图a）
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26
pH
+
-
a
实用文档
27
由于载体两性电解质是一系列不同 分子的两性电解质的混合物所组成的， 设 其 中 某 一 成 分 为 A， 它 的 pI=pH’， 当环境中的pH>pH’时，它带负电荷， 朝正极移动。(图b)
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55
三、IEFE的基本原理
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7
蛋白质分子在不同pH下的解离状态
NH3+ P
COOH
NH3+ P
COO-
NH2 P
COO-
pH＜pI pI
pH＝pI
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pH＞
8
在电泳介质中放入载体两性电解 质，当通入直流电时，两性电解质 形成一个由正极到负极逐渐增加的 pH梯度，正极附近是低pH区，负 极附近是高pH区。
其次一些低pI的载体两性电解质分子（荷其 次多的负电）也将向阳极移动，直到它的净电 荷被减少到零才停止。
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21
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22
㈢电泳结束后的变化 所有的载体两性电解质分子以增加pI级数的
办法将分别在阳、阴极之间到达它们自己的位 置而给出一个pI梯度。
实用文档
23
实用文档
24
实用文档
25
电解槽中，通电后，正负两极都会发生电
实用文档
18
pH梯度形成的过程
实用文档
19
㈠没通电时的变化
所有的载体两性电解质分子都荷电，只是溶 液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷 为零。
实用文档
20
㈡引入电场时的变化
载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移， 带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最 快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置 时才停止。
等电聚焦就是在电泳介质中放入载体 两性电解质，当通以直流电时，两性电
解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加 的pH梯度，在此体系中，不同的蛋白质 即移动到或聚焦于其相当的等电点位置 上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中， 电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电 泳。
实用文档
3
二、IEFE的特点
（一）优点
1.分辨率高（精密度可达0.01pH单位）， 灵敏度高（最低检出量达0.1ng）。
实用文档
39
1.各种染色法
考马斯亮蓝染色 银染色 同工酶染色 专一蛋白染色 荧光标记以及免疫方法
实用文档
40
2.扫描与定量
激光光源强度大、单色性好，所以 对IEFE谱带的扫描最合适。 注意：操作程序和条件必须严格相同
实用文档
41
3.其它检测方法
电泳转移 双相电泳 滴定曲线分析
实用文档
①分子量要小，以便与被分离大分子物质分离；
②化学性质稳定；
③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好 的缓冲能力；
④在pI处具有足够的电导，导电性均匀；
⑤两性电解质载体的数目要足够多；
⑥可溶性好；
⑦对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度， 不干扰样品的测定。
实用文档
14
2.载体两性电解质的合成
42
蛋白质样品及分离容量
1、电聚焦有高的分辨力，一般样品不需提 纯，分析上可用来测定混合物中某一成 分的相对比例。
2、大量提纯蛋白质，则应预先初步提纯。 有些物质（如核酸）聚焦时会沉淀，应 预先除去。
3、蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大， 易发热，而且盐离子迁移至两极产生酸 碱，占据了分离的有效部位。
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50
HbF
1866年发现，是胎儿和初生儿的Hb的 主要成分，足月的初生婴儿血中大约有 70-80%为HbF，其余为HbA。婴儿出 生后不久，HbF的浓度迅速减少，同时 HbA相应增多，绝大多数正常人于出生 后6个月至2年后，HbF便降至成人的正 常浓度，以后HbF一直存在。
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51
[器材]
实用文档
44
四、等点聚焦电泳的应用
1.分析分离制备蛋白质、多肽 ①区分人血清蛋白 ②测出异常免疫球蛋白 ③基因分型 ④csf中寡克隆区带的检测 2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽 3.双相电泳中，IEFE作为第一相
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45
实用文档
46
参考书目
《蛋白质电泳实验技术》 科学出版社 郭尧君 《蛋白质技术手册》 科学出版社 汪家政 范敏 主编 《电泳》 科学出版社 何忠效 张树政 主编
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34
pH梯度的选择
在测定未知蛋白时，可先采用 pH3-10的载体，经初步测定后改用 较窄的以提高分辨率。
实用文档
35
实用文档
36
实用文档
37
（二）支持介质的选择
作用：防止扩散 抗对流
1.液体介质：蔗糖、Ficoll 2.凝胶介质：琼脂糖，葡聚糖、PAG
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38
（三）聚焦后的检测方法
实用文档
9
蛋白质分子的电聚焦过程
+
pI1
+
pI2 pI3 —
pH=pI
pIn
-
a
b
a. 蛋白质分子在负极端 实用文档
c
10
在 这 个 从 正 极 到 负 极 pH 逐 渐 增 加 的直流电场中，当蛋白质进入这个环境， 不同的蛋白质带上不同性质和数量的电 荷，向着一定方向移动，迁移到与其相 同的等电点位置上停留下来，即被聚焦 于一个狭的区带中 ，得以分离。
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52
[试剂]
分离胶缓冲液 Acr-Bis TEMED、AP Ampholine 电极缓冲液（0.2%H2SO4、2%NaOH）
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53
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
[操作]
1.凝胶的制备 2.电泳 3.剥胶 4.观察结果
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54
[思考题]
1.PAGE与IEFE有何区别？ 2.本实验的关键步骤是什么？
等电聚焦电泳
Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEFE
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1
一、IEFE 定义
IEFE 一 种 利 用 具 有 pH 梯 度 的支持介质分离等点电不同的蛋 白质的电泳技术。
实用文档
2
各种蛋白质各自都有一个等电点,在一 特殊的pH环境中,蛋白质分子呈电中性, 在电场中不会迁移。
2.电泳区带相当狭窄。 3.重复性好。
实用文档
4
（二）缺点
1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋 白质可能发生沉淀。
2.样品中的成分必须停留在其pI，不适 用 在pI不溶或发生变性的蛋白质。
实用文档
5
分辨率较不连续PAGE更高，特别 适合于分离分子量相同而电荷不同 的生物大分子。
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47
实验 血红蛋白的等点聚焦电泳
实用文档
48
[原理]
Hb具有四条多肽链和球蛋白
（α、β、γ、δ）
pI
HbA α2β2 HbA2 α2δ2 HbF α2γ2 HbA3
>95% 6.87 2-3% 7.38 <2% 6.98
<6.87
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49
HbA 正常成人血中主要的Hb成分。
HbA2 正常成人Hb中的一个次要成分， 当 胎儿出生时，其浓度不到1%，以后 稍增多，在正常成人中其平均值自 2.2% 至2.6%左右，最高范围一般 不超过3.5%。
实用文档
11
进行IEFE必须具备3个条件：
①有一个在电泳条件下基本稳定、重 复性良好的pH梯度
②有一个抗对流的电泳材料，使已经 分离的样品不再重新混合
③电泳后有适当的方法来鉴定分离的 区带
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12
（一）pH梯度的建立
用多种两性电解质混合物建立稳定 良好的pH梯度
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13
1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes）应具备的特征：
加成反应
丙烯酸+多乙烯多胺
（LKB）
Ampholine
本质：一系列脂肪族多氨基多羧酸同系物 和异构体，具有很多既不相同又十分接 近相互连接的pI值。
pH范围：pH3~10
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3.pH梯度的形成
载体两性电解质是一系列不同分 子的两性电解质的混合物,在通电后， 它们各自迁移到适当位置形成一个 连续的pH梯度。
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43
等电点聚焦的分离容量受下列几个因素影响：
1、聚焦后每一区带的蛋白量取决于密度梯 度所能支持的蛋白质，提高密度可以提 高分离容量；
2、容量与区带高度的平方成正比，降低电 压可使区带变宽，提高容量，但分辨率 降低，聚焦时间长，用窄的pH梯度范围 可以使区带变宽，提高分辨率。
3、分离的容量与柱的横载面成正比，用440 毫克柱时，可加粗蛋白质5克，每一区带 可达一克。
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pH
ApH=p H’
+
b
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-
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当 环 境 pI<pH’ 时 ， 它 带 正 电 荷 ， 朝负极移动，直至移动到它的等点电处， 在那里聚集。由于两性电解质A在它的pI 处具有一定的缓冲能力，因此在它附近 形成一个pH稳定区域。（图c）
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30
pH
pH=p A+ H’
+
c
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-
31
同样载体两性电解质中各种两性 电解质也会各自迁移到它们的等电点处， 由于它们的数量足够多，各自的等电点 相差很小，从而形成一个pH梯度。（图 d）
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32
pH
+
-
d
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假设在一个系统中含有极多的有 适当的等电点和它的等电点处有一 定的缓冲能力的两性电解质，因此 形成的pH梯度将是连续平滑的。
极反应：
正极端反应：6H2O→O2+4H3O++4e负极端反应：4H2O+4e-→2H2+4OH-
在负极引起pH值的升高，在正极 pH下降，另外在电极槽的正极端放的是 酸性溶液，负极端放的是碱性溶液造成 了在电极附近pH的急剧变化。（图a）
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pH
+
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a
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由于载体两性电解质是一系列不同 分子的两性电解质的混合物所组成的， 设 其 中 某 一 成 分 为 A， 它 的 pI=pH’， 当环境中的pH>pH’时，它带负电荷， 朝正极移动。(图b)
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55
三、IEFE的基本原理
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7
蛋白质分子在不同pH下的解离状态
NH3+ P
COOH
NH3+ P
COO-
NH2 P
COO-
pH＜pI pI
pH＝pI
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pH＞
8
在电泳介质中放入载体两性电解 质，当通入直流电时，两性电解质 形成一个由正极到负极逐渐增加的 pH梯度，正极附近是低pH区，负 极附近是高pH区。
其次一些低pI的载体两性电解质分子（荷其 次多的负电）也将向阳极移动，直到它的净电 荷被减少到零才停止。
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21
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㈢电泳结束后的变化 所有的载体两性电解质分子以增加pI级数的
办法将分别在阳、阴极之间到达它们自己的位 置而给出一个pI梯度。
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25
电解槽中，通电后，正负两极都会发生电
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pH梯度形成的过程
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19
㈠没通电时的变化
所有的载体两性电解质分子都荷电，只是溶 液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷 为零。
实用文档
20
㈡引入电场时的变化
载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移， 带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最 快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置 时才停止。
等电聚焦就是在电泳介质中放入载体 两性电解质，当通以直流电时，两性电
解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加 的pH梯度，在此体系中，不同的蛋白质 即移动到或聚焦于其相当的等电点位置 上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中， 电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电 泳。
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二、IEFE的特点
（一）优点
1.分辨率高（精密度可达0.01pH单位）， 灵敏度高（最低检出量达0.1ng）。
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39
1.各种染色法
考马斯亮蓝染色 银染色 同工酶染色 专一蛋白染色 荧光标记以及免疫方法
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40
2.扫描与定量
激光光源强度大、单色性好，所以 对IEFE谱带的扫描最合适。 注意：操作程序和条件必须严格相同
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41
3.其它检测方法
电泳转移 双相电泳 滴定曲线分析
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①分子量要小，以便与被分离大分子物质分离；
②化学性质稳定；
③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好 的缓冲能力；
④在pI处具有足够的电导，导电性均匀；
⑤两性电解质载体的数目要足够多；
⑥可溶性好；
⑦对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度， 不干扰样品的测定。
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14
2.载体两性电解质的合成
42
蛋白质样品及分离容量
1、电聚焦有高的分辨力，一般样品不需提 纯，分析上可用来测定混合物中某一成 分的相对比例。
2、大量提纯蛋白质，则应预先初步提纯。 有些物质（如核酸）聚焦时会沉淀，应 预先除去。
3、蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大， 易发热，而且盐离子迁移至两极产生酸 碱，占据了分离的有效部位。
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HbF
1866年发现，是胎儿和初生儿的Hb的 主要成分，足月的初生婴儿血中大约有 70-80%为HbF，其余为HbA。婴儿出 生后不久，HbF的浓度迅速减少，同时 HbA相应增多，绝大多数正常人于出生 后6个月至2年后，HbF便降至成人的正 常浓度，以后HbF一直存在。
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51
[器材]
实用文档
44
四、等点聚焦电泳的应用
1.分析分离制备蛋白质、多肽 ①区分人血清蛋白 ②测出异常免疫球蛋白 ③基因分型 ④csf中寡克隆区带的检测 2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽 3.双相电泳中，IEFE作为第一相
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参考书目
《蛋白质电泳实验技术》 科学出版社 郭尧君 《蛋白质技术手册》 科学出版社 汪家政 范敏 主编 《电泳》 科学出版社 何忠效 张树政 主编
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34
pH梯度的选择
在测定未知蛋白时，可先采用 pH3-10的载体，经初步测定后改用 较窄的以提高分辨率。
实用文档
35
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36
实用文档
37
（二）支持介质的选择
作用：防止扩散 抗对流
1.液体介质：蔗糖、Ficoll 2.凝胶介质：琼脂糖，葡聚糖、PAG
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38
（三）聚焦后的检测方法
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蛋白质分子的电聚焦过程
+
pI1
+
pI2 pI3 —
pH=pI
pIn
-
a
b
a. 蛋白质分子在负极端 实用文档
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在 这 个 从 正 极 到 负 极 pH 逐 渐 增 加 的直流电场中，当蛋白质进入这个环境， 不同的蛋白质带上不同性质和数量的电 荷，向着一定方向移动，迁移到与其相 同的等电点位置上停留下来，即被聚焦 于一个狭的区带中 ，得以分离。