脉冲场凝胶电泳实验流程

脉冲场凝胶电泳实验流程一、准备样品1. 琼脂糖包埋的样品常用的DNA提取方法不能得到完整的大分子量DNA。

大分子量DNA很脆弱，在制备过程中容易因移液等操作造成机械剪切。

将完整细胞包埋入琼脂糖后再进行裂解，去除蛋白的操作，可防止大分子量DNA的断裂。

琼脂糖块包埋的DNA可以避免被机械剪切，并且是一种简单的操作方法。

处理过的包埋有DNA的琼脂糖块可以直接放入琼脂糖凝胶的点样孔。

在将细胞包埋入琼脂糖之前要先确定细胞浓度，尽管吸光度很常用，但是并不可靠。

单位吸光度对应的细胞浓度会因菌株不同或培养基不同而有差异。

这会影响琼脂糖块中DNA的含量，导致上样量过大或不足。

不论细菌、真菌还是哺乳动物细胞，使用血球计数板均可得到准确和高重复性的细胞浓度。

Bio-Rad提供一次性的样品模具（货号：170-3713）。

每个模具可制备50个10 x 5 x 1.5 mm的琼脂糖胶块。

样品制备过程中的酶可以快速有效的扩散进入胶块，用Bio-Rad标准梳子制胶，胶块不需要修剪就可直接放入点样孔。

2. 液体样品小于200kb的DNA片断可以不用琼脂糖包埋，可直接以液体形式加入点样孔。

当操作的DNA大于50kb时，必须用大开口的吸头。

如果只电泳液体样品，使用厚度0.75 mm的梳子可以获得更锐利的条带和更高的分辨率。

3. 制备琼脂糖包埋的哺乳动物DNA该方法中用到的缓冲液，酶和琼脂糖均包含于试剂盒CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit （货号：170-3591）。

1)将细胞悬浮于等渗盐溶液或不含血清的培养基中并置于冰上。

用血球计数板对细胞计数，每毫升琼脂糖块需要5 x 107个细胞，每个10 x 5 x 1.5 mm的样品块需要0.1 mL琼脂糖。

2)准备2% CleanCut™琼脂糖（货号：170-3594），用微波炉融化并置于50 °C水浴。

3)1000g、4 °C离心细胞悬液5分钟，用琼脂糖块一半体积的细胞悬浮缓冲液（10 mM Tris, pH 7.2,20 mM NaCl, 50 mM EDTA）重悬细胞并置于50 °C水浴。

4)将细胞悬液与等体积的2% CleanCut琼脂糖轻揉且彻底混匀并放回50 °C水浴，用移液器将混合物加入样品模具。

静置使琼脂糖凝固，可以将模具置于4 °C冰箱10-15 min，这样可以加速凝固并增加琼脂糖的强度以方便从模具中移出。

5)使用50 mL离心管，每1 mL琼脂糖块加入5 mL蛋白酶K反应液（100 mM EDTA, pH 8.0, 0.2%sodium deoxycholate, 1% sodium lauryl sarcosine, 1 mg/mL Proteinase K）。

将凝固的琼脂糖块从模具中捅入盛有蛋白酶K反应液的50 mL离心管中。

于50 °C水浴中消化过夜，不需要振荡。

注：根据细胞特性不同，有的样品需要延长消化时间至4天，但这并不会损伤DNA。

6)用50 mL洗涤缓冲液（20 mM Tris, pH 8.0, 50 mM EDTA）洗涤琼脂糖块4次，于室温轻柔振荡，每次30-60 min。

如果样品接下来要进行限制性内切酶消化，建议在第2、3次洗涤时加入1 mMPMSF使残余的蛋白酶K失活。

7)琼脂糖块可于4 °C保存3个月至1年。

8)琼脂糖块可于洗涤缓冲液中长期保存，但必须在限制性内切酶消化前降低EDTA浓度。

请在酶切前用10倍稀释的洗涤缓冲液或TE（10 mM Tris, 1mM EDTA, pH8.0）洗涤琼脂糖块30分钟。

4. 制备琼脂糖包埋的细菌DNA该方法中用到的缓冲液，酶和琼脂糖均包含于试剂盒CHEF Bacterial Genomic DNA Plug Kit （货号：170-3592）。

1)用50mL LB培养基或其他培养基培养细菌至OD600到达0.8 - 1.0。

2)当OD600到达0.8 - 1.0，加入氯霉素至终浓度180μg/m L并继续培养1小时注：氯霉素可使不同细菌个体间染色体复制同步化并抑制染色体下一轮的复制。

本步骤为可选步骤，但省略此步骤会导致靠近染色体复制终点的区域含量较低。

过长时间的氯霉素处理会导致细胞形态变化，因此请迅速进入下一步操作。

3)将上步得到的细菌培养液稀释20倍计数：取10μL上步得到的细菌培养液，加入20μL GramCrystal Violet和170μL PBS，用血球计数板在400倍镜下计数。

4)准备2% CleanCut™琼脂糖（货号：170-3594），用微波炉融化并置于50 °C水浴。

5)每毫升琼脂糖块需要5 x 108个细菌。

离心收集细菌，并用琼脂糖块一半体积的细胞悬浮缓冲液（10 mM Tris, pH 7.2, 20 mM NaCl, 50 mM EDTA）重悬细胞并置于50 °C水浴。

注：有些细菌对EDTA浓度或悬浮缓冲液的渗透压敏感，并因此而提前裂解，这将导致DNA不适合脉冲场凝胶电泳。

有些细菌如Enterococci需要悬浮缓冲液中含有1M NaCl才能防止因渗透压导致的裂解。

又如Pseudomonas对EDTA浓度敏感，需要对悬浮缓冲液进行稀释才能避免过早裂解。

尽管大多数的细菌不需要改变悬浮缓冲液，但还是要尽可能快地完成细菌包埋。

6)将细胞悬液与等体积的2% CleanCut琼脂糖轻揉且彻底混匀并放回50 °C水浴，用移液器将混合物加入样品模具。

静置使琼脂糖凝固，可以将模具置于4 °C冰箱10-15 min，这样可以加速凝固并增加琼脂糖的强度以方便从模具中移出。

7)用50mL离心管，每1 mL琼脂糖块加入5mL lysozyme反应液(10 mM Tris, pH 7.2, 50 mM NaCl,0.2% sodium deoxycholate, 0.5% sodium lauryl sarcosine, 1 mg/mL lysozyme)。

将凝固的琼脂糖块从模具中捅入盛有lysozyme反应液的50 mL离心管中。

于37 °C水浴中消化30到60分钟，不需要振荡。

注：有些细菌如Staphylococcus aureus对lysozyme不敏感，因此需用lysostaphin代替lysozyme。

8)倒掉lysozyme反应液并用25mL洗涤缓冲液（20 mM Tris, pH 8.0, 50 mM EDTA）洗涤琼脂糖块。

每1 mL琼脂糖块加入5 mL蛋白酶K反应液（100 mM EDTA, pH 8.0, 0.2% sodium deoxycholate,1% sodium lauryl sarcosine, 1 mg/ml Proteinase K）。

于50 °C水浴中消化过夜，不需要振荡。

注：根据细胞特性不同，有的样品需要延长消化时间至4天，但这并不会损伤DNA。

9)用50 mL洗涤缓冲液（20 mM Tris, pH 8.0, 50 mM EDTA）洗涤琼脂糖块4次，于室温轻柔振荡，每次30-60 min。

如果样品接下来要进行限制性内切酶消化，建议在第2、3次洗涤时加入1 mMPMSF使残余的蛋白酶K失活。

10)琼脂糖块可于4 °C保存3个月至1年。

11)琼脂糖块可于洗涤缓冲液中长期保存，但必须在限制性内切酶消化前降低EDTA浓度。

请在酶切前用10倍稀释的洗涤缓冲液或TE（10 mM Tris, 1mM EDTA, pH8.0）洗涤琼脂糖块30分钟。

5. 制备琼脂糖包埋的酵母DNA该方法中用到的缓冲液，酶和琼脂糖均包含于试剂盒CHEF Yeast Genomic DNA Plug Kit （货号：170-3593）。

1)用50mL到100mL YPG培养基或其他培养基培养酵母至OD600超过1.0。

2)当OD600达到1.0，5000g、4 °C离心10分钟收集酵母。

并用10mL冰冷的50mM，pH8.0的EDTA溶液重悬酵母。

3)取10μL酵母悬液加入990μL水，用血球计数板于400倍镜下计数。

4)准备2% CleanCut™琼脂糖（货号：170-3594），用微波炉融化并置于50 °C水浴。

5)每毫升琼脂糖块需要6 x 108个真菌。

离心收集真菌，并用琼脂糖块一半体积的细胞悬浮缓冲液（10 mM Tris, pH 7.2, 20 mM NaCl, 50 mM EDTA）重悬真菌并置于50 °C水浴。

6)在酵母悬液中加入Lyticase至1 mg/mL，并立即进行下一步。

注：有些酵母在包埋后用Lyticase消化效果不佳，故推荐在包埋前将Lyticase加入酵母悬液。

7)将细胞悬液与等体积的2% CleanCut琼脂糖轻揉且彻底混匀并放回50 °C水浴，用移液器将混合物加入样品模具。

静置使琼脂糖凝固，可以将模具置于4 °C冰箱10-15 min，这样可以加速凝固并增加琼脂糖的强度以方便从模具中移出。

8)用50mL离心管，每1 mL琼脂糖块加入5mL lyticase反应液(10 mM Tris, pH 7.2, 50 mM EDTA, 1mg/ml lyticase)。

将凝固的琼脂糖块从模具中捅入盛有lyticase反应液的50 mL离心管中。

于37 °C水浴中消化30到60分钟，不需要振荡。

9)倒掉lyticase反应液并用25mL洗涤缓冲液（20 mM Tris, pH 8.0, 50 mM EDTA）洗涤琼脂糖块。

每1 mL琼脂糖块加入5 mL蛋白酶K反应液（100 mM EDTA, pH 8.0, 0.2% sodium deoxycholate,1% sodium lauryl sarcosine, 1 mg/ml Proteinase K）。

于50 °C水浴中消化过夜，不需要振荡。

注：根据细胞特性不同，有的样品需要延长消化时间至4天，但这并不会损伤DNA。

10)用50 mL洗涤缓冲液（20 mM Tris, pH 8.0, 50 mM EDTA）洗涤琼脂糖块4次，于室温轻柔振荡，每次30-60 min。

如果样品接下来要进行限制性内切酶消化，建议在第2、3次洗涤时加入1 mMPMSF使残余的蛋白酶K失活。

11)琼脂糖块可于4 °C保存3个月至1年。

12)琼脂糖块可于洗涤缓冲液中长期保存，但必须在限制性内切酶消化前降低EDTA浓度。

请在酶切前用10倍稀释的洗涤缓冲液或TE（10 mM Tris, 1mM EDTA, pH8.0）洗涤琼脂糖块30分钟。

6. 加快样品制备过程在某些情况下，上面的流程可以简化以加快样品制备速度。