第十二章动物干细胞技术简介
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4.胚胎干细胞：存在于早期胚胎，获取胚胎干细胞来源比较困难，道 德伦理风险不容忽视，因此胚胎干细胞在临床治疗中使用颇受争议,
胚胎干细胞，又称全能干细胞，存在于未发育成熟的胚胎 ，高水平表达端粒酶，可分化为除构成脐胎盘，脐带等之 外的任何一种特定类型细胞。即能长成动物的任何组织和 器官。
(1)全能性干细胞它具有形成完整个体的分化潜能。如胚 胎干细胞，具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的 分化能力，可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类 型，进一步形成机体的所有组织、器官。
细胞周期的特征
端粒酶
一种自身携带模板的逆转录酶， 由RNA和蛋白质组成，RNA组 分中含有一段短的模板序列与 端粒DNA的重复序列互补，而 其蛋白质组分具有逆转录酶活 性，以RNA为模板催化端粒 DNA的合成，将其加到端粒的 3′端，以维持端粒长度及功能。
第三节 胚胎干细胞的分离培养
分化抑制物的选择和培养基的设计 早期胚胎的选择及培养 分离及培养过程 ES细胞的鉴定 ES细胞的冷冻保存 ES细胞系的建立及保存
2.骨髓间充质干细胞：人体骨髓干细胞细胞数量及增殖分化 潜能随年龄的增大而下降，从自体骨髓提取间充质干细胞， 虽然技术门槛比较低，但需要抽取病人大量骨髓（往往难以 做到），其干细胞数量也难以稳定满足临床治疗的要求。因 此骨髓间充质干细胞有一定的局限。
3.脐带血干细胞：脐带血除了包含正常血液的红细胞、白细胞，淋巴 细胞外，还包含单个核细胞、造血干细胞。目前最具应用价值的是利 用脐血中的造血干细胞治疗白血病（骨髓移植）。利用脐带血所含的 单个核细胞和造血干细胞治疗血液病以外的疾病，由于所含干细胞数 量稀少（仅占脐血细胞的0.98%），虽然有一定的治疗效果，但不能 等同于真正意义上的间充质干细胞治疗，可作为间充质干细胞治疗的 补充。
一、概述 二、胚胎干细胞研究的意义 三、胚胎干细胞研究的历史 四、胚胎干细胞分离培养的基本程序 五、胚胎干细胞技术目前存在的问题和发展远
景
胚胎干细胞技术
Embryonic Stem cells (ES cells)
一、概述
➢哺乳动物胚胎干Biblioteka Baidu胞（embryonic stem cells,
ES细胞） 一般是指从早期胚胎经体外分化抑 制培养分离出来的具有全能性的细胞。
第四节 胚胎干细胞的定向分化
胚胎性干细胞定向分化的常用策略 分化细胞的鉴定与纯化
干细胞应用
细胞替代
✓ 治疗角膜病、糖尿病、帕金森病 实例
组织替代
✓ 治疗如皮肤、软组织、骨骼等组织病变
器官替代
✓ 无排斥反应的器官移植
干细胞培植眼角膜 进行眼角膜移植修 补手术
干细胞培植心肌 细胞治疗原发性 心脏病
➢ES细胞是由Evans和Kauf-man1981年首次从
延迟小鼠囊胚中分离出来的多能性细胞，当 时称之为EK细胞。以后称之为胚胎干细胞。
特异性标志分子的表达
ES细胞的全能性指ES细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖 腺在内的各种组织的发育潜力，即ES细胞具有发育成完整动物体的 能力，可以为细胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的试验材料。
ES细胞发育全能性的标志是ES细胞表面表达时相专一性胚胎抗原 （Stage specific embryonicant，SSEA），而且可以检查到OTC4基 因的表达，这两种蛋白是发育全能性的标志。ES细胞中AKP及端粒 酶活性较高，可用于ES细胞分化与否的鉴定。
骨髓干细胞可以 自行转移到人脑， 并可以转变为功 能齐全的脑细胞 治疗脑损伤、老 年痴呆症以及帕 金森氏综合症
骨髓间充质干细胞
加入造血干细胞
造血干细胞增殖分化
双刃剑
人类基因组计划引发伦理、法律和社 会问题
克隆人与人兽杂交克隆造成伦理观念 的冲击
生物技术被别有居心者的使用
动物 胚胎干细胞的分离培养技术 Embryonic Stem cells（ES cells）
第二节胚胎干细胞的特性
形态学特征
ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细 胞核大，有一个或几个核仁，胞核中多为常染色 质，胞质胞浆少，结构简单。体外培养时，细胞 排列紧密，呈集落状生长。用碱性磷酸酶染色， ES细胞呈棕红色，而周围的成纤维细胞呈淡黄色。 细胞克隆和周围存在明显界限，形成的克隆细胞 彼此界限不清，细胞表面有折光较强的脂状小滴。 细胞克隆形态多样，多数呈岛状或巢状。小鼠ES 细胞的直径7 μm～18 μm，猪、牛、羊ES细胞的 颜色较深，直径12 μm～18 μm。
ES细胞的多能性是指ES细胞具有发育成多种组织的能力，参与部分 组织的形成。将ES细胞培养在不含分化抑制物的培养基上，可以形 成类胚体。
将ES细胞在特定培养基进行培养，可以定向分化成特定组织，如ES 细胞在含有白血病抑制因子（LIF）和维生素A酸（RA）的培养基上， 可以分化形成全壁内胚层，将ES细胞与胚胎细胞共培养或将ES细胞
第一节 干细胞简介
干细胞的定义 自我更新和分化潜能的细胞,在细胞发育过程中处于较原 始阶段.
干细胞的分类 干细胞有两方面区别于其它细胞的特征： 1，可分化为与自身完全相同的细胞，
2，可生产出特异性分化的细胞。
根据个体发育过程中出现的先后次序不同，干细胞可分为 两类：胚胎干细胞及成体干细胞。
1.带间充质干细胞：大量存在于脐带组织中，具有胚胎干细 胞类似的增殖能力和多向分化潜能，来源丰富、取材方便、 无道德伦理争议，可获取的细胞数量多、活力强，疗效显著 ，可以扩增和传代，同时又没有配型、排斥等问题，不但能 够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，也是最具临床应用 前景的多能干细胞。
(2)多能性干细胞这种干细胞具有分化出多种组织细胞的
潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到 一定的限制。骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分 化出至少12种血细胞，但不能分化出造血系统以外的其它 细胞。 (3)单能干细胞 也称专能或偏能干细胞。这类干细胞只能 向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组 织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞或叫卫星细胞。
胚胎干细胞，又称全能干细胞，存在于未发育成熟的胚胎 ，高水平表达端粒酶，可分化为除构成脐胎盘，脐带等之 外的任何一种特定类型细胞。即能长成动物的任何组织和 器官。
(1)全能性干细胞它具有形成完整个体的分化潜能。如胚 胎干细胞，具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的 分化能力，可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类 型，进一步形成机体的所有组织、器官。
细胞周期的特征
端粒酶
一种自身携带模板的逆转录酶， 由RNA和蛋白质组成，RNA组 分中含有一段短的模板序列与 端粒DNA的重复序列互补，而 其蛋白质组分具有逆转录酶活 性，以RNA为模板催化端粒 DNA的合成，将其加到端粒的 3′端，以维持端粒长度及功能。
第三节 胚胎干细胞的分离培养
分化抑制物的选择和培养基的设计 早期胚胎的选择及培养 分离及培养过程 ES细胞的鉴定 ES细胞的冷冻保存 ES细胞系的建立及保存
2.骨髓间充质干细胞：人体骨髓干细胞细胞数量及增殖分化 潜能随年龄的增大而下降，从自体骨髓提取间充质干细胞， 虽然技术门槛比较低，但需要抽取病人大量骨髓（往往难以 做到），其干细胞数量也难以稳定满足临床治疗的要求。因 此骨髓间充质干细胞有一定的局限。
3.脐带血干细胞：脐带血除了包含正常血液的红细胞、白细胞，淋巴 细胞外，还包含单个核细胞、造血干细胞。目前最具应用价值的是利 用脐血中的造血干细胞治疗白血病（骨髓移植）。利用脐带血所含的 单个核细胞和造血干细胞治疗血液病以外的疾病，由于所含干细胞数 量稀少（仅占脐血细胞的0.98%），虽然有一定的治疗效果，但不能 等同于真正意义上的间充质干细胞治疗，可作为间充质干细胞治疗的 补充。
一、概述 二、胚胎干细胞研究的意义 三、胚胎干细胞研究的历史 四、胚胎干细胞分离培养的基本程序 五、胚胎干细胞技术目前存在的问题和发展远
景
胚胎干细胞技术
Embryonic Stem cells (ES cells)
一、概述
➢哺乳动物胚胎干Biblioteka Baidu胞（embryonic stem cells,
ES细胞） 一般是指从早期胚胎经体外分化抑 制培养分离出来的具有全能性的细胞。
第四节 胚胎干细胞的定向分化
胚胎性干细胞定向分化的常用策略 分化细胞的鉴定与纯化
干细胞应用
细胞替代
✓ 治疗角膜病、糖尿病、帕金森病 实例
组织替代
✓ 治疗如皮肤、软组织、骨骼等组织病变
器官替代
✓ 无排斥反应的器官移植
干细胞培植眼角膜 进行眼角膜移植修 补手术
干细胞培植心肌 细胞治疗原发性 心脏病
➢ES细胞是由Evans和Kauf-man1981年首次从
延迟小鼠囊胚中分离出来的多能性细胞，当 时称之为EK细胞。以后称之为胚胎干细胞。
特异性标志分子的表达
ES细胞的全能性指ES细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖 腺在内的各种组织的发育潜力，即ES细胞具有发育成完整动物体的 能力，可以为细胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的试验材料。
ES细胞发育全能性的标志是ES细胞表面表达时相专一性胚胎抗原 （Stage specific embryonicant，SSEA），而且可以检查到OTC4基 因的表达，这两种蛋白是发育全能性的标志。ES细胞中AKP及端粒 酶活性较高，可用于ES细胞分化与否的鉴定。
骨髓干细胞可以 自行转移到人脑， 并可以转变为功 能齐全的脑细胞 治疗脑损伤、老 年痴呆症以及帕 金森氏综合症
骨髓间充质干细胞
加入造血干细胞
造血干细胞增殖分化
双刃剑
人类基因组计划引发伦理、法律和社 会问题
克隆人与人兽杂交克隆造成伦理观念 的冲击
生物技术被别有居心者的使用
动物 胚胎干细胞的分离培养技术 Embryonic Stem cells（ES cells）
第二节胚胎干细胞的特性
形态学特征
ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细 胞核大，有一个或几个核仁，胞核中多为常染色 质，胞质胞浆少，结构简单。体外培养时，细胞 排列紧密，呈集落状生长。用碱性磷酸酶染色， ES细胞呈棕红色，而周围的成纤维细胞呈淡黄色。 细胞克隆和周围存在明显界限，形成的克隆细胞 彼此界限不清，细胞表面有折光较强的脂状小滴。 细胞克隆形态多样，多数呈岛状或巢状。小鼠ES 细胞的直径7 μm～18 μm，猪、牛、羊ES细胞的 颜色较深，直径12 μm～18 μm。
ES细胞的多能性是指ES细胞具有发育成多种组织的能力，参与部分 组织的形成。将ES细胞培养在不含分化抑制物的培养基上，可以形 成类胚体。
将ES细胞在特定培养基进行培养，可以定向分化成特定组织，如ES 细胞在含有白血病抑制因子（LIF）和维生素A酸（RA）的培养基上， 可以分化形成全壁内胚层，将ES细胞与胚胎细胞共培养或将ES细胞
第一节 干细胞简介
干细胞的定义 自我更新和分化潜能的细胞,在细胞发育过程中处于较原 始阶段.
干细胞的分类 干细胞有两方面区别于其它细胞的特征： 1，可分化为与自身完全相同的细胞，
2，可生产出特异性分化的细胞。
根据个体发育过程中出现的先后次序不同，干细胞可分为 两类：胚胎干细胞及成体干细胞。
1.带间充质干细胞：大量存在于脐带组织中，具有胚胎干细 胞类似的增殖能力和多向分化潜能，来源丰富、取材方便、 无道德伦理争议，可获取的细胞数量多、活力强，疗效显著 ，可以扩增和传代，同时又没有配型、排斥等问题，不但能 够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，也是最具临床应用 前景的多能干细胞。
(2)多能性干细胞这种干细胞具有分化出多种组织细胞的
潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到 一定的限制。骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分 化出至少12种血细胞，但不能分化出造血系统以外的其它 细胞。 (3)单能干细胞 也称专能或偏能干细胞。这类干细胞只能 向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组 织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞或叫卫星细胞。