细菌的耐药性及检测

细菌的耐药性及检测：体外抗生素敏感试验方法

近年来，由于细菌耐药性不断增加，新的耐药机制和耐药菌株不断被发现，如MRSA、耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐青霉素肺炎链球菌(PRP)以及β内酰胺酶中的超广谱β内酰胺酶(ESBLs)、去阻遏持续高产AmpC酶和金属β内酰胺酶等。临床抗生素的选择使用非常困难。因此必须开展体外抗生素敏感试验，了解细菌耐药谱，对抗菌药物的临床使用效果进行预测，对患者选择个体化的治疗方案；同时通过耐药检测及流行病学调查，为医院感染控制方案制订提供依据；也有助于新药的抗菌特性研究。临床细菌学实验室应选择合适的抗菌药物用于体外药敏试验，为临床抗感染治疗提供依据。

(一)药敏试验中抗菌药物的选择原则

抗菌药物药敏试验中测试药物种类的选择，应依据各医院院内感染控制委员会、临床医师、药剂人员及微生物学检验医师等相互协商按本单位的实际情况制订，但必须满足以下条件：

1.选用的抗菌药物应具备一组或一群代表性及预示性，如具有共同的耐药机制，或对某类菌株具有特定的意义等。

2.有助于指导临床抗感染治疗和流行病学的调查。

3.应充分考虑分离菌株的来源部位，如从脑脊液分离的菌株，应选用能通过血脑屏障的抗菌药物进行体外药敏试验等。

4.根据细菌种类或来源，通常选择6～16种不同抗菌药物。

(二)选择方案

在遵循上述原则基础上，可以参照美国CLSI推荐的各菌种抗菌药物的分组选择。结合本院实际情况制定选用方案。

1.肠杆菌科细菌抗菌药物药敏试验抗菌药物选择方案

(1)首选试验和报告的抗菌药物：氨苄西林、氨苄西林／舒巴坦或阿奠西林／克拉维酸或哌拉西林／他唑巴坦或替卡西林／克拉维酸中任一种；头孢唑林或头孢噻吩、头孢呋辛或头孢孟多、头孢西丁或头孢替坦、头孢噻肟或头孢他啶或头孢曲松或头孢哌酮中任选二种；头孢吡肟或头孢匹罗；庆大霉素；环丙沙星或左氧氟沙星或培氟沙星任选1～2种；亚胺培南，复方新诺明。

(2)次选试验和报告的抗菌药物：呋喃妥因、氯霉素、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星、氨曲南、奈替米星、四环素、诺氟沙星或氧氟沙星。

(3)从肠道标本中分离的沙门菌属和志贺菌属细菌常规只应试验和报告氨苄西林、复方新诺明及一种喹诺酮类抗菌药物；分离自肠道以外的沙门菌属菌株应试验和报告多种抗菌药物的药敏试验和报告，包括氯霉素和三代头孢菌素。

(4)分离自脑脊液的肠杆菌科细菌，只需报告氨苄西林、头孢噻吩、头孢唑啉、庆大霉素的药敏结果。

(5)采用合适的方法如双纸片法等检测ESBLs；对产ES-BLs细菌，不管实际药敏检测结果如何，所有青霉素类、头孢菌素类和氨曲南的试验结果报告耐药。

2.铜绿假单胞菌和不动杆菌属等药敏试验抗菌药物选择方案

(1)首选试验和报告的抗菌药物：替卡西林或哌拉西林或美洛西林中的一种，头孢他啶、头孢哌酮、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南或美洛培南；庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素；环丙沙星等。

(2)次选试验和报告的抗菌药物：羧苄西林、头孢噻肟或头孢曲松、奈替米星、氯霉素、四环素、左氧氟沙星或诺氟沙星或氧氟沙星、复方新诺明等。

(3)除铜绿假单胞菌和不动杆菌可用纸片扩散法进行药敏试验，对其他非发酵菌应使用稀释法进行药敏试验。

3.葡萄球菌属菌种药敏试验抗菌药物选择方案

(1)首选试验和报告的抗菌药物：青霉素G、苯唑西林、头孢噻吩或头孢唑啉；红霉素或克拉霉素或阿齐霉素、克林霉素；万古霉素；复方新诺明。

(2)次选试验和报告的抗菌药物：氯霉素、环丙沙星或左氧氟沙星或氧氟沙星、庆大霉素、四环素、利福平、呋哺妥因等。

(3)青霉素G敏感的葡萄球菌对其他青霉素类、头孢菌素药物敏感；青霉素G耐药，苯唑西林敏感菌株，对β内酰胺酶不稳定的青霉素类耐药，对β内酰胺酶稳定的青霉素类、β内酰胺酶抑制剂复合制剂及头孢菌素类抗菌药物敏感；苯唑西林耐药的葡萄球菌对所有β内酰胺类抗菌药物耐药。因此只要从青霉素G及苯唑西林药敏试验结果，即可推断β内酰胺类抗菌药物的敏感性，不必对这类抗菌药物进行常规药敏试验。

(4)腐生葡萄球菌对苯唑西林的耐药表现不稳定，不能进行以上推导，应以每种抗菌药物稀释法实际检测结果判定。

4.肠球菌属药敏试验抗菌药物选择方案

(1)首选试验和报告的抗菌药物：青霉素G或氨苄西林、万古霉素。

(2)次选试验和报告的抗菌药物：庆大霉素500、链霉素2000、氯霉素、红霉素、四环素、利福平、环丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因等。由于肠球菌天然对氨基糖苷类存在低度耐药，因此在测定时必须使用高浓度药物测定，测定结果仅预示能否用常规剂量进行治疗。

(3)在体外检测肠球菌对头孢菌素娄、氨基糖苷类(除高水平耐药筛选外)、克林霉素、复方新诺明可出现敏感，但临床治疗无效，应报告耐药。

(4)不产β内酰胺酶、青霉素G敏感的肠球菌，可预示氨苄西林、阿莫西林、氨苄西林／舒巴坦、阿莫西林／克拉维酸、哌拉西林／他唑巴坦敏感。来自血液、脑脊液的菌株应检测β内酰胺酶。对严重肠球菌感染，如心内膜炎患者通常用青霉素或氨苄西林或用万古霉素加一种氨基糖苷类药物联合治疗。

(5)耐万古霉素肠球菌(VRE)可选用氯霉素、红霉素、四环素、利福平等抗菌药物作药敏试验，或和感染科医师、临床药学帅等共同商定，并将检测结果报告临床。

5.除肺炎链球菌外其他链球菌属菌药敏试验抗菌药物选择方案

(1)首选试验和报告的抗菌药物：青霉素G或氨苄西林、红霉素、氯霉素、林可霉素、万古霉素等。

(2)次选试验和报告的抗菌药物：头孢噻肟或头孢曲松、头孢吡肟、左氧氟沙星、氧氟沙星等。

(3)血液和正常无菌部位的体液分离到草绿色链球菌，应检测青霉素G的最低抑菌浓度(Minimalinhibitoryconcentration，MIC)。

(4)从尿道分离到的此类细菌，不做红霉素、氯霉素和克林霉素的常规药敏报告。

(5)不需常规进行对用于治疗A群、B群链球菌的青霉素及其他β内酰胺类抗菌药物的敏感试验。发现万古霉素耐药或中介的A群、β群链球菌菌株，应送参考实验室予以确认。

(三)体外抗菌药物敏感试验常用的检测方法

目前可用于细菌药敏检测的方法较多，常用的有纸片扩散法、肉汤稀释法、琼脂稀释法、E-test法和自动化仪器法等。根据实验室条件和需要选用不同方法。

1.稀释法有肉汤稀释法和琼脂稀释法。适用于需氧及兼性厌氧的快速生长型细菌，如肠杆菌科、非发酵菌、葡萄球菌属和肠球菌属；嗜血杆菌属、奈瑟菌属、肺炎链球菌及其他链球菌等菌株，还适用于厌氧菌、酵母样真菌及支原体等。操作步骤如下：

(1)抗菌药物的稀释：根据每种药物、细菌种类和感染部位的不同，选择不同的抗生素浓度稀释范围，用阳离子调节的M-H肉汤以2n进行倍比稀释抗菌药物(如256、128、64、～0.125……)。将稀释后的药物加人试验管，或加入冷却至45～55℃M-H琼脂培养基中，立即