大肠杆菌感受态细胞制备及质粒DNA的转化
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（1）从E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落， 接种于3ml LB液体培养基中，37℃振荡培养 过 夜 。 将 该 菌 悬 液 以 1:100 ～ 1:50 转 接 于 200ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养， 当 培 养 液 开 始 出 现 混 浊 后 ， 每 隔 20 ～ 30min 测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培 养（约2－3小时）；
转化的方法：
1. 化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如 CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处 理将载体DNA分子导入受体细胞；
2. 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的 感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体 DNA分子导入受体细胞。
克隆的筛选：
主要用不同抗生素基因筛选。常用的 抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、 氯霉素、四环素、链霉素等；
2）细胞转化
(1)取1 µl质粒DNA加入 100µl感受态细胞， 轻轻摇匀，冰上放置30min，
(2)于42℃水浴中保温1min，然后迅速冰上 冷却2min
(3) 立即向上述管中分别加入1ml LB液体培 养 基 ， 摇 匀 后 于 37℃ 振 荡 培 养 约 4560min ，使受体菌恢复正常生长状态，并 使 转 化 体 表 达 抗 生 素 基 因 产 物 (Ampr) （该步骤可以省略）。
转化（transformation）：
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细 胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程 等研究领域的基本实验技术。
进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现 遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性 状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修 饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和 甲基化酶的突变株。
3) 平板培养
(1)取 各 样 品 培 养 液 20ul 或 50ul ， 涂 布 于含Amp抗菌素的LB平板培养基上， （用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍 微凉一下再用，不要过烫）。
(2) 菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿， 于37℃恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)。
用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克 超螺旋质粒 DNA产生5106-2107个转化菌 落。在实际工作中，每微克有105以上的转 化菌落足以满足一般的克隆实验。
将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养 基中培养，才能较容易地筛选出转化体， 即带有异源DNA分子的受体细胞。否则， 如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素 的培养基平板上，会出现成千上万的细菌 菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的 质粒。
重组DNA转化细菌过 程示意图
3．操wk.baidu.com步骤
1）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
（4）4000r／min离心5min；
（6）弃去上清液，加入100µl冰冷的0.1mo1／ L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置2小时 后，即制成了感受态细胞悬液；
（7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转 化实验，也可加入占总体积15％－20％左右高 压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管 中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。
大肠杆菌感受态细胞的 制备及质粒DNA的转化
1. 实验目的和要求
通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆 菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受 体菌细胞的技术。了解细胞转化的概 念及其在分子生物学研究中的意义。
2. 相关知识及原理
感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2， 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透 性发生变化，成为能容许外源DNA的载体 分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
（ 2 ） 每 人 取 2 个 离 心 管 ， 转 入 3ml 培 养 液 （1.5mlX2），在冰上冷却2-3min，于4℃， 4000r／min离心5min（从这一步开始，所 有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；
（3）倒净上清培养液，按照0.75ml/管，用 冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细 胞，，冰浴15 min ；
转化的方法：
1. 化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如 CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处 理将载体DNA分子导入受体细胞；
2. 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的 感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体 DNA分子导入受体细胞。
克隆的筛选：
主要用不同抗生素基因筛选。常用的 抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、 氯霉素、四环素、链霉素等；
2）细胞转化
(1)取1 µl质粒DNA加入 100µl感受态细胞， 轻轻摇匀，冰上放置30min，
(2)于42℃水浴中保温1min，然后迅速冰上 冷却2min
(3) 立即向上述管中分别加入1ml LB液体培 养 基 ， 摇 匀 后 于 37℃ 振 荡 培 养 约 4560min ，使受体菌恢复正常生长状态，并 使 转 化 体 表 达 抗 生 素 基 因 产 物 (Ampr) （该步骤可以省略）。
转化（transformation）：
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细 胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程 等研究领域的基本实验技术。
进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现 遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性 状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修 饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和 甲基化酶的突变株。
3) 平板培养
(1)取 各 样 品 培 养 液 20ul 或 50ul ， 涂 布 于含Amp抗菌素的LB平板培养基上， （用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍 微凉一下再用，不要过烫）。
(2) 菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿， 于37℃恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)。
用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克 超螺旋质粒 DNA产生5106-2107个转化菌 落。在实际工作中，每微克有105以上的转 化菌落足以满足一般的克隆实验。
将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养 基中培养，才能较容易地筛选出转化体， 即带有异源DNA分子的受体细胞。否则， 如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素 的培养基平板上，会出现成千上万的细菌 菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的 质粒。
重组DNA转化细菌过 程示意图
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1）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
（4）4000r／min离心5min；
（6）弃去上清液，加入100µl冰冷的0.1mo1／ L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置2小时 后，即制成了感受态细胞悬液；
（7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转 化实验，也可加入占总体积15％－20％左右高 压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管 中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。
大肠杆菌感受态细胞的 制备及质粒DNA的转化
1. 实验目的和要求
通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆 菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受 体菌细胞的技术。了解细胞转化的概 念及其在分子生物学研究中的意义。
2. 相关知识及原理
感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2， 等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透 性发生变化，成为能容许外源DNA的载体 分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
（ 2 ） 每 人 取 2 个 离 心 管 ， 转 入 3ml 培 养 液 （1.5mlX2），在冰上冷却2-3min，于4℃， 4000r／min离心5min（从这一步开始，所 有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；
（3）倒净上清培养液，按照0.75ml/管，用 冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细 胞，，冰浴15 min ；