模拟肠道环境下肠道益生菌对三种重金属离子的富集作用的研究_张何

， 而对于重金属离子的体外肠
当前发现的通常可以吸附重金属离子的微生物种类
［10 ］ ［11 ］ ［12 ］ ， 主要是由细菌 、 真菌 和藻类 组成。
道模拟分析， 由于 pH 对其溶解析出有较大的影响，
［23 ］ 肠道模拟方法中的 pH 一般控制在 5.5 7.5 左右 。
益生菌（ Probiotics ） 是一种通过改善宿主肠道微 具有广泛的生 生物平衡而发挥作用的活性微生物， 理功 效， 能够为人体营养和健康提供良好的保 障
2+ 吸附量分别为 0.0019 mg / g 和 0.1298 mg / g； 三种肠道益生菌在模拟肠道环境下对 Pb 均无明显吸附作用。 关键词： 肠道益生菌， 肠道环境， 重金属离子， 富集
Study on the enrichment of intestinal probiotics to three heavy metal ions under simulated intestinal environment
1
1.1
材料与方法
材料与仪器
三 种 肠 道 益 生 菌 （ 嗜 酸 乳 杆 菌 （ Lactobacillus acidophilus ） ， 嗜热链球菌（ Streptococcus thermophilus ） ， 双歧杆菌（ Bifidobacterium） 北京豫鼎鑫捷科技有限 公司； 酵母膏、 蛋白胨 青岛高科园海博生物技术有 限公司； 吐温 80 、 乙 酸 钠、 磷 酸 氢 二 钾、 柠檬酸氢二 铵、 牛肉膏、 硫酸镁、 硫酸锰、 葡萄糖、 六次甲基四胺、 重铬酸钾、 二甲酚橙、 孔雀绿、 邻苯二甲酸氢钾、 硝酸 、 镉 硝酸铅 生工生物工程上海（ 股份） 有限公司； 二 苯碳酰二肼 上海科兴商贸有限公司； 所用试剂均 为分析纯， 使用前未进一步纯化， 实验用水为电阻率 · cm 的超纯水。 大于 18 MΩ 电热 恒 温 培 养 箱 天 津 市 泰 斯 特 仪 器 公 司； TDL－40B 型离心机、 DHG－9240A 型电热恒温鼓风干 燥箱 上海基玮实验仪器设备有限公司； UV － 1800 型紫外－ 可见分光光度计 日本岛津公司； 超纯水器 瑞世康 重庆力德高端水处理设备； 厌氧培养罐 科技有限公司。
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作用， 能够为益生菌在食品中的进一步应用提供 支持。
2+ 摇匀静置 20 min ， 于室温 25 ħ 时， 以不加 Cd 溶液 为参比， 在波长为 578.4 nm 处测定吸光度并绘制标 ［25 ］ 准曲线 。 1.2.2.3 二 价 铅 （ Pb （ NO3 ） 2 ） 标 准 曲 线 将 0.00 、 0.50 、 1.00 、 1.50 、 2.00 、 2.50 mL 的 100 mg / L 的铅标准 分别加入0.5 mL 溶液依次加入到 50 mL 的容量瓶中，
［26 ］ 测定吸光度并绘制标准曲线 。 1.2.3 三种肠道益生菌对三种重金属的吸附特性测
定
三种肠道益生菌分别在加入一定浓度重金属离 子（ 六价铬（ 0.05 mg / L ） 、 二价镉（ 0.3 mg / L ） 、 二价铅 （ 2 mg / L） ） 的模拟肠道环境的 MRS 培养基中培养， 平行三次。在无菌操作下每隔 4 h 移取 5 mL 肠道益 生菌（ 双歧杆菌、 嗜酸乳杆菌、 嗜热链球菌） MRS 培养 在 4000 r / min 下离心 10 min 后， 移取 液于离心管中， 0.5 mL 上清培养液于 50 mL 容量瓶中待测， 另取一 50 mL 容量瓶加入 0.5 mL MRS 培养液（ 未加重金属 离子） 作为对照， 依次加入相应的反应试剂（ 所加试 立即摇匀， 用蒸馏水 剂与标准曲线测定试剂一致） ， 定容至刻度。 反应完成后， 在相应波长下测定其吸 光度， 然后由标准曲线计算出溶液中重金属离子的 浓度。
0.0021 mg / g； 嗜热链球菌对 Cr6 + 、 Cd2 + 均有较强的吸附和富集作用， 最大吸附率分别为 50% 和 62% ， 吸附量分别为 0.0015 mg / g 和 0.1057 mg / g； 双歧杆菌对 Cr6 + 、 Cd2 + 均有较强的吸附和富集作用， 最大吸附率分别为 66.6% 和 69.9% ，
ZHANG He， LUO Cheng－ yin， FU Xin （ School of Chemistry and Chemical Engineering， Hunan Institute of Engineering， Xiangtan 411104 ， China） Abstract ： In this paper， the absorption characteristics of Lactobacillus acidophilus， Streptococcus thermophilus and Bifidobacterium to Cr6 + 、 Cd 2 + 、 Pb 2 + under the simulated intestine environment were studied. The results indicated and the adsorption ratio was 70 % and the Lactobacillus acidophilus had strong adsorption and enrichment to Cr6 + ， the adsorption amount was 0.0021 mg / g. Streptococcus thermophilus also had strong adsorption and enrichment to Cr6 + and Cd 2 + ， and the adsorption ratio was 50 % and 62 % ， and the adsorption amount was 0.0015 mg / g and 0.1057 mg / g ， respectively. Bifidobacterium also had strong adsorption and enrichment to Cr6 + and Cd 2 + ， and the adsorption ratio was 66.6 % and 69.9 % ，and the adsorption amount was 0.0019 mg / g and 0.1298 mg / g ， respectively. There was no obvious adsorption of Pb 2 + among the three kinds of intestinal probitics under simulated intestinal environment. Key words： intestinal probiotics； intestinal environment； heavy metal ions； enrichment 中图分类号： TS201.4 文献标识码： A doi： 10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2015． 21． 064 文 章 编 号： 1002－0306 （ 2015 ） 21－0349－05
模拟肠道环境下肠道益生菌 对三种重金属离子的富集作用的研究
张 何， 罗程印， 傅 昕 （ 湖南工程学院化学化工学院， 湖南湘潭 411104 ）
6+ 摘 要： 本研究考察了嗜酸乳杆菌、 嗜热链球菌、 双歧杆菌三种肠道益生菌在模拟肠道环境条件下生长情况及对 Cr 、 2+ 2+ 6+ Cd 、 Pb 的吸附特性。 结果显示： 嗜酸乳杆 菌 对 Cr 有 较 强 的 吸 附 和 富 集 作 用， 最 大 吸 附 率 为 70% ， 吸附量为
未加铅离子的空白 MRS 培养液， 然后分别加入 2 mL 0.05% 孔雀绿， 2 mL pH4.0 的 Clark－ Lubs 缓冲溶液， 10 mL KI （ 10% ） ， 用 蒸 馏 水 定 容 至 刻 度， 静置反应 2+ 10 min ， 以不加 Pb 溶液为参比， 在波长为 700 nm 处
2.2 分析
6+ Cd2 + 、 Pb2 + 的 吸 附 特 性 嗜 酸 乳 杆 菌 对 Cr 、
微生物对重金属的吸附作用机理为：wenku.baidu.com重金属对 比如 微生物的生长代谢过程有着非常重要的作用， Zn 、 Ni、 Cr 等在微生物的生化反应过程中起着催化剂 可以稳定蛋白质的结构、 细胞壁以及可以维 的作用， Cd 、 Hg 、 Pb 等非必需元素则 持渗透压的平衡； 而 Ag 、 能够与配基反应， 从 可以取代结合位点的必需元素， ［27 ］ 。 而达到吸附及富集的作用 嗜酸乳杆菌是一类存在于胃和小肠内具有调整 肠道菌群平衡、 抑制肠道不良微生物的增殖益生菌。 考察了嗜酸乳杆菌在模拟肠道环境的培养过程中对 三种重金属离子的吸附特性 。从图 2 曲线 a 可看出，
［13－19 ］
本研究考察了三种肠道益生菌（ 双歧杆菌、 嗜酸乳杆 菌、 嗜热链球菌） 在模拟肠道环境条件下对重金 属 （ 铬、 镉、 铅） 的吸附性能， 探索其减弱重金属危害的 有益性， 可更加全面的认识肠道益生菌的健康维护
。由于益生菌对人体有着极其重要的保健功
收稿日期： 2015－01－23 E－ mail： mzhang_he@ 126.com。 作者简介： 张何（ 1977－ ） ， 男， 博士， 副教授， 研究方向： 生物分析化学， 14JJ3133 ） ； 湖南省教育厅优秀青年基金（ 12B029 ） ； 湖南工程学院博士启动基金。 基金项目： 湖南省自然科学基金 （ 2015JJ2039 ，
1.2
1.2.1
实验方法
益生菌的培养
为了考察模拟肠道环境下益 采用 MRS 为细菌培养 生菌对金属离子的富集作用，
pH 为 6.8 。 采用的 MRS 基， 温度控制在 37 ħ 左右， 培养基成分为： 酵母膏 5.0 g ； 吐温 80 1.0 mL； 乙酸钠 5.0 g ； 磷酸氢二钾 2.0 g ； 柠檬酸氢二铵 2.0 g ； 牛肉膏 10 g ； 硫酸镁 0.58 g ； 硫酸锰 0.189 g ； 葡萄糖 20.0 g ； 蛋 pH 调节至 6.8 ， 在 121 ħ 白胨 10 g ； 蒸馏水 1000 mL， 蒸汽灭菌 30 min 。将实验室保藏的菌种划线接种到 MRS 固体培养基， 37 ħ 培养 24 32 h ， 长出单菌落后 确定为纯种， 再将纯菌种接种 进行革兰氏染色镜检， 于 37 ħ 、 到 MRS 液 体 培 养 基 中 扩 增。 接 种 后， 180 r / min 条件下培养， 而由于双歧杆菌需要在厌氧 静置条件下培养， 但为了增加传值， 每天摇动培养瓶 2 3 次。 三种重金属标准曲线的测定 1.2.2.1 六价铬（ K2 Cr2 O7 ） 标准曲线 1.2.2 分别准确移取 0.00 、 0.50 、 1.00 、 2.00 、 4.00 、 8.00 、 16.00 mL 的铬标准溶
－5 液（ 1 ˑ 10 mol / L） 于 7 个 50 mL 容量瓶中， 再向每 个 50 mL 容量瓶中加入 0.5 mL 未加铬离子的空白
2
2.1
结果与分析
三种重金属离子标准曲线的建立
在优化的实验条件下， 按照实验方法对不同浓 2－ 2+ 度 的 六 价 铬 （ Cr2 O7 ） 、 二 价 镉 （ Cd ） 和 二 价 铅 （ Pb2 + ） 体系 进 行 测 定， 分别建立了标准曲线（ 如图 1 ） 。标 准 曲 线 线 性 关 系 良 好， 可用于后续的含量 测定。
随着人类对重金属的开采 、 冶炼、 加工以及工业 造成大量重金属如铅、 汞、 镉、 铬等 废水的不当排放， 进入大气、 水、 土壤中， 造成了严重的环境污染。 近 食品安全事件也频频发生 年来，
［1－3 ］
能， 已被广泛应用于食品、 医药保健等领域， 如活性 酸奶等。 然而， 肠道益生菌对于肠道 益生菌乳饮料、 中重金属的吸附及转化性能研究还未见报道 。 环境中污染物对人体的生物有效性胃肠体外实 验始于营养学研究食物中铁元素对人体的生物有效 性
［20 ］
。 在对重金属处
理的方法中， 生物处理技术已被证明比传统的化学 沉淀法、 离子交换法、 活性炭吸附法等更为优越， 而 生物处 理 法 中 目 前 应 用 最 多 的 是 生 物 吸 附 法 较多
［6－9 ］ ［4－5 ］
。MRS 培养基是一种用于模拟体外胃肠道环境
［21－22 ］
。
的常用细菌培养基