高效苯酚降解菌的分离与降解特性
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由于工农业迅猛发展, 同时对含酚废水的配 方监管漏洞, 如今含酚废水的不合理排放污染了 水资源, 严重影响了人们的身心健康, 并已成为 城市可 持续发展道路 上的障碍。水 是生命之源, 由于水循环过程又污染了整个生态系统, 进而威 胁到人类的生存质量, 由此改善水污染环境已迫 在眉睫。目前虽然含酚污水的研究很广泛, 但对 高浓度含酚污水的研究仍有深度可挖, 因此必须 在排水之前将其浓度降低稀释, 利用生物法处理 含酚废水。此方法危害, 经济, 效率高。因此抗 性菌的特性即利用价值受到重视, 利用抗性菌高
基金项目: 佳木斯大学学生创新课题 ( 课题编号: Dz2011- 021) * 为通讯作者
# 25 # 2011 年 8 月
农业与技术来自百度文库
Vol. 31 No. 4
菌种的富集与驯化采用一次性加入大剂量化 合物的方法[ 8] 。将菌种在无菌条件下接种到 20mL 细菌富集固体培养 基中, 25 e 培养 箱中培养 48h 后, 挑拣 长势 好的菌 体分 别接 种于 苯酚 含量为 50mg/ L 和 100mg/ L 的细菌驯化固体培养基中, 置 于培养箱中培养 48h。共驯化 5 个 周期, 同时苯 酚浓度由 0115、0120、0125g/ L 浓度梯度逐渐递增 到 0175g/ L 。与此同时选用摇床培养作为参考[ 9] 。 11212 高效苯酚降解菌的分离筛选及鉴定
( 2) 选 择 培养 基[ 1] : KNO3410g, NaCl 510g, 琼 脂 1510g, 污 水 1000mL, pH 710 ~ 712, 1 @ 105Pa 灭菌 15min。待冷却后加入 1510mL 经过灭菌 处理的不同浓度的苯酚溶液制成固体培养基, 然 后用平板涂布法接种, 等 3 天后观察菌的长势情 况, 观察和记录。 112 实验方法 11211 高效苯酚降解菌的富集与驯化
第 31 卷 第 4 期 2011 年 8 月
农业与技术 Ag riculture& T echnology
Vol131 No14
Aug12011
# 24#
高效苯酚降解菌的分离与降解特性
谷凤丽 李长明 马海燕 杨国坤 韩旭东 崔亚旭 秋梦影 张跃华*
( 佳木斯大学生命科学学院, 黑龙江 佳木斯 154007)
效率的降解苯酚的能力净化废水、保护环境, 对 维持可持续发展有极其深远的意义。
黑龙化工厂地处松花江上游, 其沿岸区域有 大面积农作物种 植区, 利用松 花江水进行灌溉, 而含酚废水直接排入江中则将对农作物造成毒害 作用, 同时人们 适用后有毒物 质在人体内富集, 进而对人体有直接或潜在的威胁。借以东北地区 特有的寒冷气候, 苯酚降解菌的研究也对将来大 面积的低温微生物的研究提供了参考资料。
参考文献
[ 1] 黄蓓佳, 张兰英, 等. 低温 条件下1, 2, 4 - 三 氯苯降 解菌的 筛选 及降解特性 [ J] . 环境科学研究, 2008, 21 ( 5) : 19- 22
[ 2] 金相灿, 程振华, 等. 有机化合物污染化学 [ M ] . 北京: 清 华大学出版社, 1999: 250- 265
[ 3] Gibson DT. M icrobial degradation of aromatic compounds [ J] . Sc-i ence, 1968, ( 161) : 1093- 1097
[ 4] Rodriguez I, Liompart MP, Cela R . Solidphase extractionof phenols [ J] . Journal of Chromatography A, 2000, 885 ( 1/ 2) : 291- 304
种于鉴别培养基, 25 e 恒温培养 48h 后观察并记 录。 º 细菌的简单染色实验和革兰氏染色实验见 文献 [ 10] 。
2 主要环境因子对高效菌生长剂降解苯酚 能力的影响
211 pH 值对降解菌的影响 将筛选出的 7 株抗性菌分离出来, 用筛选培
养基分别培养。将他们分别接种到不同 pH 值的 固体 培 养基 上, pH 值的 梯 度分 别 为 612、614、 616、618、710、712、714、716, 以此获得降解菌 的最适 pH 值, 培养 48 小时后观察并记录。
108mL、接种量 12mL、摇床振荡速度 110r/ min 及固体培养条件下培养 48h, 观察抗性菌生长的状态, 菌落数量及测定吸 光度值从而
判定对苯酚的降解情况。
=关键词> 高效; 苯酚降解菌; 降解特性
中图分类号: O625131
文献标识码: A
苯酚 ( C6H6OH, PhOH ) , 又名石炭酸、羟基 苯, 是结构最简单的酚类有机物, 弱有机酸, 常 温下为无色晶体, 微溶于水, 易溶于有机剂, 当 温度高于 65 e 时, 能跟水以任意比例互溶。有毒 性和腐蚀性, 低浓度酚溶液使蛋白变性, 高浓度 则使蛋白质沉淀。对皮肤和粘膜有强烈的腐蚀作 用, 也可抑制 中枢神经系统和 损害肝、肾功能。 其溶液沾到皮肤上应立即用酒精擦洗。
[5] 简放棱, 黄凯那. 合成酚醛树脂废 水前处理 初探 [ J ] . 仲剀 农业技术学院学报, 2000, 13 ( 1) : 40- 44
[ 6 ] Fewson CA. The identity of the gramnegative bacteriumNCIB8250 [ J] . J G en M icrobiol , 1967, ( 48) : 107- 110
菌悬液, 按 12mL 的接种量接到 pH712, 苯酚初始 浓 度 分 别 为 0105、 0110、 0115、 0120、 0125、 0130、 0135、 0140、 0145、 0150、 0155、 0160、 0165、0170、0175g/ L 的 培 养基 中, 于 110r/ min、 25 e 摇床振荡培养, 48h 后测 培养基的吸光 度及 计算残余的苯酚浓度。
[ 7] Andrzej W, Trochimczzuk, M ichael Streat. Highly polarpolymericsorbent s characterizat ion and sorptive properties towards phenol andits derivatives [ J ] . Reactive and Funct ionalPolymers, 2001, 46 ( 3) : 259- 271
1 材料与方法
111 材 料 11111 样品来源
佳木斯黑龙化工厂排污口。 11112 培养基
( 1) 富集培养基: 蛋白胨 510g, 牛肉膏 115g, NaCl 115g, 污 水 1000mL, 琼脂 1510g, pH 710 ~ 712, 培养基在 1 @ 105Pa 灭菌 15min 后备用。然后 将浓 度为 10- 1, 10- 2, 10- 3, 10- 4, 10- 5的土 样 溶液接种到富集培养基上, 培养 48h 后观察。
pH 值 吸光度值
表 1 pH 值对菌株的影响 ( 分解能力最强的 4 号菌株为例)
612
61 4
616
61 8
710
712
71 4
01 976
01 850
01743
01 598
01512
01 386
01 943
716 11256
212 苯酚初始浓度的影响 将用选择培养基扩大培养的生长状况良好的
待测的各种菌体分离出来, 用筛选培养基培养分 离得到的各种菌, 无菌条件下用划线法将纯菌落 接种到固体培养基上。将得到的菌体用更高浓度 的苯酚培养基驯化以待变异成更具降解能力的降 解菌, 与此同时将得到的苯酚降解菌配成无机盐
=摘 要> 从佳木斯黑龙化工厂活性污泥中筛选到 7 株高效苯酚降解菌, 其可以利用苯酚作为唯一的碳源和 能源物质。通过这 7
株菌在不同的温度、pH 值及浓度下生长和苯酚降解情况的研究, 确定了此 7 株菌的最适生长温度 25 e , 最适 pH 值 71 2, 并测得降
解最大的酚浓度 700mg/ L。该 7 株苯酚 降解菌 的降解 能力研 究表 明: 其 具有较 强的 苯酚 降解能 力, 在 25 e , pH 值 712、装 液量
人的苯酚口服致死量报道不一, LD 为 2~ 15g 或 MLD 为 140mg/ kg。国外报道酚液污染皮肤面积 达 25% , 血酚浓度为 0174mmol/ L, 10 分钟死亡。 酚类会对人类的身心健康造成危害, 毒害其他生 物, 破坏了生态系统的稳定性, 故我国及其他国 家都将其列入重点污染物名单。目前研究人员已 获得的降酚菌包括真养产碱杆菌 ( Alcaligenes eutrophus) [ 2] 、醋酸钙不动杆菌 ( A1calcoaceticus) [ 3] 、 藻类 ( Alga Ochromonas danica) [ 4] 、根瘤菌 ( Rhizobia) [ 5] 、假单胞菌 ( Pseudonomonassp. ) [ 6] 、酵母菌 ( Yeast Trichosporon cutaneum) [ 7] 等苯酚降解菌。
( 1) 分离和纯化: 待降解菌长势稳定后用平 板划线法, 挑取单菌落进行细菌的分离, 反复纯 化 5 次后, 将培养的纯种菌种接种至斜面培养基 上继续培养。
( 2) 菌种筛选: 划线法挑取少量的单一菌落 分离出单一的降解菌继续培养待鉴定, 并将其编
号 1、2、3、4、5、6、7。 ( 3) 菌种鉴定: ¹ 用接种环挑取少量菌落接
图 1 苯酚浓度对菌株降解性的影响
Vol. 31 No. 4
农业与技术
2011 年 8 月 # 26#
3 结果与分析
311 结 果 31111 筛选出 7 株降解能力强的菌株对苯酚都有 一定的 点适应性, 且 对苯酚有很强 的降解能力, 其 015g/ L 和 0165g/ L 浓度的苯酚降解率达到 90% 以上, 最大苯酚降解浓度达到 0170g/ L。 31112 通过对这 7 株菌在 不同温度、pH 值、以 及不同苯酚浓度下的生长和苯酚降解情况的考察, 确定了这 7 株菌的最适 pH 值为 712, 最适生长温 度为 25 e , 最大可降解苯酚浓度为 0170g/ L。 31113 在低温下生物降解苯酚的代谢基质中若加 一些有机碳源或无机盐可以促进降解作用, 如葡 萄糖、硫酸铵, 硫酸铵对低温条件下苯酚的微生 物降解具有促进作用, 可以考虑在菌群驯化和低 温苯酚类降解过程中添加一些。 312 分 析
[8] 任源, 吴超飞, 等. 苯胺分离菌的 驯化筛选 研究 [ J ] . 环境 科学研究, 1998, 4 ( 11) : 4- 26
[ 9] 马放, 任南琪, 等. 污染控制 微生物学 实验 [ M ] . 哈 尔滨: 哈尔滨工业大学出版社, 2002: 67- 82
作者简介: 谷凤丽, 女, 佳木斯大学生命科学学院。 张跃华 ( 1962- ) , 男, 博士, 硕士生导师。
基金项目: 佳木斯大学学生创新课题 ( 课题编号: Dz2011- 021) * 为通讯作者
# 25 # 2011 年 8 月
农业与技术来自百度文库
Vol. 31 No. 4
菌种的富集与驯化采用一次性加入大剂量化 合物的方法[ 8] 。将菌种在无菌条件下接种到 20mL 细菌富集固体培养 基中, 25 e 培养 箱中培养 48h 后, 挑拣 长势 好的菌 体分 别接 种于 苯酚 含量为 50mg/ L 和 100mg/ L 的细菌驯化固体培养基中, 置 于培养箱中培养 48h。共驯化 5 个 周期, 同时苯 酚浓度由 0115、0120、0125g/ L 浓度梯度逐渐递增 到 0175g/ L 。与此同时选用摇床培养作为参考[ 9] 。 11212 高效苯酚降解菌的分离筛选及鉴定
( 2) 选 择 培养 基[ 1] : KNO3410g, NaCl 510g, 琼 脂 1510g, 污 水 1000mL, pH 710 ~ 712, 1 @ 105Pa 灭菌 15min。待冷却后加入 1510mL 经过灭菌 处理的不同浓度的苯酚溶液制成固体培养基, 然 后用平板涂布法接种, 等 3 天后观察菌的长势情 况, 观察和记录。 112 实验方法 11211 高效苯酚降解菌的富集与驯化
第 31 卷 第 4 期 2011 年 8 月
农业与技术 Ag riculture& T echnology
Vol131 No14
Aug12011
# 24#
高效苯酚降解菌的分离与降解特性
谷凤丽 李长明 马海燕 杨国坤 韩旭东 崔亚旭 秋梦影 张跃华*
( 佳木斯大学生命科学学院, 黑龙江 佳木斯 154007)
效率的降解苯酚的能力净化废水、保护环境, 对 维持可持续发展有极其深远的意义。
黑龙化工厂地处松花江上游, 其沿岸区域有 大面积农作物种 植区, 利用松 花江水进行灌溉, 而含酚废水直接排入江中则将对农作物造成毒害 作用, 同时人们 适用后有毒物 质在人体内富集, 进而对人体有直接或潜在的威胁。借以东北地区 特有的寒冷气候, 苯酚降解菌的研究也对将来大 面积的低温微生物的研究提供了参考资料。
参考文献
[ 1] 黄蓓佳, 张兰英, 等. 低温 条件下1, 2, 4 - 三 氯苯降 解菌的 筛选 及降解特性 [ J] . 环境科学研究, 2008, 21 ( 5) : 19- 22
[ 2] 金相灿, 程振华, 等. 有机化合物污染化学 [ M ] . 北京: 清 华大学出版社, 1999: 250- 265
[ 3] Gibson DT. M icrobial degradation of aromatic compounds [ J] . Sc-i ence, 1968, ( 161) : 1093- 1097
[ 4] Rodriguez I, Liompart MP, Cela R . Solidphase extractionof phenols [ J] . Journal of Chromatography A, 2000, 885 ( 1/ 2) : 291- 304
种于鉴别培养基, 25 e 恒温培养 48h 后观察并记 录。 º 细菌的简单染色实验和革兰氏染色实验见 文献 [ 10] 。
2 主要环境因子对高效菌生长剂降解苯酚 能力的影响
211 pH 值对降解菌的影响 将筛选出的 7 株抗性菌分离出来, 用筛选培
养基分别培养。将他们分别接种到不同 pH 值的 固体 培 养基 上, pH 值的 梯 度分 别 为 612、614、 616、618、710、712、714、716, 以此获得降解菌 的最适 pH 值, 培养 48 小时后观察并记录。
108mL、接种量 12mL、摇床振荡速度 110r/ min 及固体培养条件下培养 48h, 观察抗性菌生长的状态, 菌落数量及测定吸 光度值从而
判定对苯酚的降解情况。
=关键词> 高效; 苯酚降解菌; 降解特性
中图分类号: O625131
文献标识码: A
苯酚 ( C6H6OH, PhOH ) , 又名石炭酸、羟基 苯, 是结构最简单的酚类有机物, 弱有机酸, 常 温下为无色晶体, 微溶于水, 易溶于有机剂, 当 温度高于 65 e 时, 能跟水以任意比例互溶。有毒 性和腐蚀性, 低浓度酚溶液使蛋白变性, 高浓度 则使蛋白质沉淀。对皮肤和粘膜有强烈的腐蚀作 用, 也可抑制 中枢神经系统和 损害肝、肾功能。 其溶液沾到皮肤上应立即用酒精擦洗。
[5] 简放棱, 黄凯那. 合成酚醛树脂废 水前处理 初探 [ J ] . 仲剀 农业技术学院学报, 2000, 13 ( 1) : 40- 44
[ 6 ] Fewson CA. The identity of the gramnegative bacteriumNCIB8250 [ J] . J G en M icrobiol , 1967, ( 48) : 107- 110
菌悬液, 按 12mL 的接种量接到 pH712, 苯酚初始 浓 度 分 别 为 0105、 0110、 0115、 0120、 0125、 0130、 0135、 0140、 0145、 0150、 0155、 0160、 0165、0170、0175g/ L 的 培 养基 中, 于 110r/ min、 25 e 摇床振荡培养, 48h 后测 培养基的吸光 度及 计算残余的苯酚浓度。
[ 7] Andrzej W, Trochimczzuk, M ichael Streat. Highly polarpolymericsorbent s characterizat ion and sorptive properties towards phenol andits derivatives [ J ] . Reactive and Funct ionalPolymers, 2001, 46 ( 3) : 259- 271
1 材料与方法
111 材 料 11111 样品来源
佳木斯黑龙化工厂排污口。 11112 培养基
( 1) 富集培养基: 蛋白胨 510g, 牛肉膏 115g, NaCl 115g, 污 水 1000mL, 琼脂 1510g, pH 710 ~ 712, 培养基在 1 @ 105Pa 灭菌 15min 后备用。然后 将浓 度为 10- 1, 10- 2, 10- 3, 10- 4, 10- 5的土 样 溶液接种到富集培养基上, 培养 48h 后观察。
pH 值 吸光度值
表 1 pH 值对菌株的影响 ( 分解能力最强的 4 号菌株为例)
612
61 4
616
61 8
710
712
71 4
01 976
01 850
01743
01 598
01512
01 386
01 943
716 11256
212 苯酚初始浓度的影响 将用选择培养基扩大培养的生长状况良好的
待测的各种菌体分离出来, 用筛选培养基培养分 离得到的各种菌, 无菌条件下用划线法将纯菌落 接种到固体培养基上。将得到的菌体用更高浓度 的苯酚培养基驯化以待变异成更具降解能力的降 解菌, 与此同时将得到的苯酚降解菌配成无机盐
=摘 要> 从佳木斯黑龙化工厂活性污泥中筛选到 7 株高效苯酚降解菌, 其可以利用苯酚作为唯一的碳源和 能源物质。通过这 7
株菌在不同的温度、pH 值及浓度下生长和苯酚降解情况的研究, 确定了此 7 株菌的最适生长温度 25 e , 最适 pH 值 71 2, 并测得降
解最大的酚浓度 700mg/ L。该 7 株苯酚 降解菌 的降解 能力研 究表 明: 其 具有较 强的 苯酚 降解能 力, 在 25 e , pH 值 712、装 液量
人的苯酚口服致死量报道不一, LD 为 2~ 15g 或 MLD 为 140mg/ kg。国外报道酚液污染皮肤面积 达 25% , 血酚浓度为 0174mmol/ L, 10 分钟死亡。 酚类会对人类的身心健康造成危害, 毒害其他生 物, 破坏了生态系统的稳定性, 故我国及其他国 家都将其列入重点污染物名单。目前研究人员已 获得的降酚菌包括真养产碱杆菌 ( Alcaligenes eutrophus) [ 2] 、醋酸钙不动杆菌 ( A1calcoaceticus) [ 3] 、 藻类 ( Alga Ochromonas danica) [ 4] 、根瘤菌 ( Rhizobia) [ 5] 、假单胞菌 ( Pseudonomonassp. ) [ 6] 、酵母菌 ( Yeast Trichosporon cutaneum) [ 7] 等苯酚降解菌。
( 1) 分离和纯化: 待降解菌长势稳定后用平 板划线法, 挑取单菌落进行细菌的分离, 反复纯 化 5 次后, 将培养的纯种菌种接种至斜面培养基 上继续培养。
( 2) 菌种筛选: 划线法挑取少量的单一菌落 分离出单一的降解菌继续培养待鉴定, 并将其编
号 1、2、3、4、5、6、7。 ( 3) 菌种鉴定: ¹ 用接种环挑取少量菌落接
图 1 苯酚浓度对菌株降解性的影响
Vol. 31 No. 4
农业与技术
2011 年 8 月 # 26#
3 结果与分析
311 结 果 31111 筛选出 7 株降解能力强的菌株对苯酚都有 一定的 点适应性, 且 对苯酚有很强 的降解能力, 其 015g/ L 和 0165g/ L 浓度的苯酚降解率达到 90% 以上, 最大苯酚降解浓度达到 0170g/ L。 31112 通过对这 7 株菌在 不同温度、pH 值、以 及不同苯酚浓度下的生长和苯酚降解情况的考察, 确定了这 7 株菌的最适 pH 值为 712, 最适生长温 度为 25 e , 最大可降解苯酚浓度为 0170g/ L。 31113 在低温下生物降解苯酚的代谢基质中若加 一些有机碳源或无机盐可以促进降解作用, 如葡 萄糖、硫酸铵, 硫酸铵对低温条件下苯酚的微生 物降解具有促进作用, 可以考虑在菌群驯化和低 温苯酚类降解过程中添加一些。 312 分 析
[8] 任源, 吴超飞, 等. 苯胺分离菌的 驯化筛选 研究 [ J ] . 环境 科学研究, 1998, 4 ( 11) : 4- 26
[ 9] 马放, 任南琪, 等. 污染控制 微生物学 实验 [ M ] . 哈 尔滨: 哈尔滨工业大学出版社, 2002: 67- 82
作者简介: 谷凤丽, 女, 佳木斯大学生命科学学院。 张跃华 ( 1962- ) , 男, 博士, 硕士生导师。