高效苯酚降解菌的分离与降解特性
一株好氧反硝化苯酚降解菌的筛选和降解特性分析
一株好氧反硝化苯酚降解菌的筛选和降解特性分析一、前言苯酚是一种常见的有机化合物，广泛应用于各种工业领域中，但长期的排放和使用会对环境产生严重的污染。
因此，开发一种高效的苯酚降解菌对于环境保护至关重要。
本研究旨在筛选一株好氧反硝化苯酚降解菌，并对其降解特性进行分析。
二、材料与方法2.1 筛选苯酚菌本实验采用活性污泥为菌源，经过序列分离筛选获得苯酚降解菌。
分离后的菌株进行纯化后，经过16S rDNA序列比对确定其菌种。
2.2 生长条件的优化在不同的培养基和培养条件下，探究苯酚降解菌的最适生长条件，并确定其最适浓度和最适pH值等。
2.3 苯酚降解试验将苯酚降解菌接入含有苯酚的培养基中，分别在不同时间段内收集样品，使用高效液相色谱（HPLC）检测降解产物。
2.4 剖析苯酚降解代谢途径通过GC-MS分析降解菌代谢苯酚的代谢产物，分析苯酚降解代谢途径。
三、结果分析经过序列分析和比对，鉴定出本次筛选获得的菌株为一株好氧反硝化菌，归属于福克斯氏菌属。
本次实验结果显示，最适生长温度为30℃，最适pH值为7.5，最适浓度为250mg/L。
本次实验结果显示，在48小时内，苯酚的降解率可达到85%，降解产物主要为苯酚羟基化物。
GC-MS分析结果显示，菌株代谢苯酚主要通过羟基化、甲基化、环化等途径进行，其中苯酚加氧羟基化产物的比例最高。
四、结论本研究成功筛选出一株好氧反硝化苯酚降解菌，其最适生长条件为30℃，pH值为7.5，浓度为250mg/L。
在48小时内，苯酚降解率达到了85%，代谢途径主要为羟基化、甲基化、环化等。
本研究的结果对于苯酚的治理与处理具有重要的实践意义。
苯酚降解菌的分离和鉴定
目录目录 (1)摘要 (2)Abstract (3)第一章绪论 (4)1.1 苯酚降解菌的定义及分类 (4)1.2苯酚降解菌的性质及其用途 (4)1.3苯酚降解的研究现状 (5)1.4苯酚降解菌生产菌的筛选 (6)1.5本课题的研究思路及意义 (6)第二章材料与方法 (7)2.1试验材料 (7)2.2试验方法 (8)2.2.2苯酚降解菌的驯化 (8)2.2.3菌种在不同条件下的降解能力 (9)2.2.4最优菌种的鉴定 (9)3.1苯酚降解菌筛选结果及性状初步研究 (11)3.11筛选结果 (11)3.1.1.1初步筛选的结果 (11)3.1.1.2 菌种驯化中的结果 (11)3.1.2 H-1菌株的性状初步结果 (13)3.2 H-1菌株分类鉴定结果 (13)第四章结论 (14)4.1菌种的筛选结果 (14)4.2菌种的鉴定 (14)参考文献 (15)致谢.......................................................................................... 错误!未定义书签。
一株苯酚降解菌的分离和鉴定摘要为了寻找能高效降解苯酚的微生物, 从土壤中筛选得到了一株苯酚降解菌,通过逐渐增加苯酚的浓度,然后驯化出一株高效降解苯酚的细菌H-1. 当在30 ℃培养48h 时其降解率高达92.11%. 经理化特征测定及外观鉴定,将其初步鉴定为假单胞菌属.再经过对比实验测各种因素(碳源、温度、pH、通气) 对该菌生长及降解苯酚能力的影响,得知该菌能以苯酚作为唯一碳源,最适生长温度为32 ℃,最适pH 为7.0. 该菌为好氧菌,在空气充足的条件下可提高降解能力.该菌菌落较小，菌落呈微黄色。
菌体呈直或微弯的杆装，没有菌柄也没有鞘。
不产芽孢。
对该菌做生化鉴定，可知该菌革兰氏染色为阴性，可水解苯酚，生长温度为32℃，生长pH为pH 6.5～7.5。
苯酚降解菌TX1的分离鉴定及其降解特性
Ｋｅ ｒ ｓ Ｐｈ ｎ Ｉ Ｔ ／ ｈ ｓ ｏ ｏ Ｃａ ｅ ｈ １ ２ ｄ ｏ ｙ ｅ ａ ｅ Ｇｒ ｗｔ ｉ ｅ ｉｓ ｙ ｗｏ ｄ ： ｅ ｏ ｒ ｏ ｐ ｒ ｎ ｃ ｔ ｃ ｏＩ ． － ｉ ｘ ｇ ｎ ｓ ｏ ｈ ｋｎ ｔ ｃ
Ｉｄ ｃｂｅ ｉｔａ ｅｌ ｌ ｅ ｚ ｍ ｅ Ｗ ｉ ｈｅｄａａ ｏｂ ａｎ ｄ ｉ ａ ｃ ｕｔ ｆ ｈ ｔａｎ ＴＸ１ ｔ ｗｔ ｉｅ ｉｓ ｎ ｕ ｉｌ ｎ ｒ ｃ ｌ ａｒ ｎ ｙ ． ｕ ｔ ｔ ｔ ｔ ｉｅ ｎ ｂ ｔ ｈ ｃ ｌ ｒ ｏ ｅ ｓ ｒ ｉ ｈ ｕｅ ｔ ，ｉ ｇ ｏ ｈ ｋｎ ｔ ｓ ｒ ｃ
ｇｅ ｕ ｒｃ ｏ ｐ ｒ ｎ ｓ ｎ ｍ ｅ Ｘ１ ｎ ｓＴｉｈ ｓ ｏ ｏ ｐ． ａ ｄＴ ．Ｔｈ ｒ ｌ ｎ ｒ ｔ ｄ ｎｔ ｅｍｅ ａ ｏｉ ａ ｈ ｙｏ ｈ ｏ ｂ ｕ ｓｓｒ ｎ ｅｐ ｅｉ ａ ｙｓｕ ｙｏ ｈ ｔ ｂ ｌ ｐ ｔｗａ ｆｐ ｅｎ ｌ ｏ ｌｈｉ ｔａｉ ｍｉ ｃ ａ ｔ
Ｓａｇ ａ ｎｉ ｓ ｅｔ Ｓｉ］ ｓ ｈｎ ｈｉ Ｅ ｖ ｏｍ ｎａ ｃ ｒｅ ｒＴ ｌ ｅｃ
苯 酚降解 菌 Ｔ 的分 离鉴 定及其 降解特性 Ｘ１
邱凌峰
苯酚降解菌 Ｔ 的分离鉴定及其降解特性 Ｘ １
ｓ ｌｔｏ ，Ｉｅ ｔｆ ａ ｉｎ ｎ Ｃｈ ｒｃ ｅ ｉａ ｉｎ ｆ ｈ ｎ —Ｄｅ ｒｄｎ ｏａ ｉｎ ｄ ｎ ｉｉ ｔｏ ａ ｄ ｃ ａａ ｔｒｚ ｔＯ Ｏ Ｐ ｅ ＯＩ ｇ ａ ｉｇ
Ｋ ｓ
氧 酶 （ ２ ０） 位 途 径 开 环 ， 成 丙 酮 酸 和 乙醛 。 后 Ｃ ３ 间 形 最
苯酚高效降解菌的筛选及其降解特性研究
ｔａ ｉ ｎ ｙ Ｗ ｕ ｔＣ ｒ ｔｏ ｓ ｂ ｓ－
２ ４ 固 定 化 Ｗ ｕｔ ． ｓ Ｃ对 苯 酚 的 降解 效 果 －
通 过 比 较 采 用 ２ ５ １ 、 、 ０ ｍＬ 注 射 器 制 作 的 Ｗ ｕｔＣ固定 化 小球 （ 别 记 为 １ ２ ３ ｓ— 分 、 、 小 球 ）
８６ ４ 、 ９ ３ 、 ７． 、 １ 。 ． ５ 。 ４ ６ ４ ．７
茅醇假 单胞 菌 ） 降解 苯酚 的效 率 明显 高 于 其 他 菌
株 ， 选其 作为研 究 菌株 ， 故 其革 兰 氏染 色结 果为 阴
性。
通过 一系列 的降 解 条件 优 化 试 验 发现 ， 酚 含
经 反 复驯化 、 涂板 分离 ， 共得 到 ８株 以苯酚 为
惟 一碳 源 和能源 而高 效生 长 的菌株 。通过 比较 发 现其 中 ３号 菌 株 （ 名 为 Ｗ ｕｔ 初 步鉴 定 为香 命 ｓ Ｃ， —
降解 不 同浓度 的苯 酚 。初 始 苯 酚浓 度 越 低 ， 解 降
所需 时 间越短 。在 初始 苯酚 浓度 为 ３ ０ｍｇ Ｉ 和 ０ ／ ５ ０ｍｇ Ｌ的 试 样 中 ， 酚 完 全 降解 所 需 的 时 间 ０ ／ 苯 分别 为 ８ｈ和 １ ； 初始 苯酚浓 度 为 ｌ ０ ／ ２ｈ 在 ０ｍｇ ０ Ｌ的试样 中， 酚完 全降解 所需 的时 问为 ３ ； 苯 ２ｈ 在 初 始苯 酚浓度 为 １６ ０ｍｇ Ｌ的试样 中 ， ０ ／ 菌体 的生 长 速度和 苯 酚的 降解 速度 均 极 其缓 慢 。培 养 ４ ｈ 时 ， ｓ Ｃ 对 初 始 含 酚 浓 度 分 别 为 ３ ０ ５ ０ Ｗｕ ｔ — ０、 ０、 ８ ０ １０ ０ｍｇ Ｉ 试 样 中的 苯酚 降解 率 分 别 达 到 ０ 、 ０ ／
一株土壤中苯酚降解菌的分离、鉴定及降解特性研究
一株土壤中苯酚降解菌的分离、鉴定及降解特性研究崔树军;金维平;张建云;陈红歌;张庆甫【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2009(000)004【摘要】采用富集培养的方法,从焦化废水污染的土壤中分离得到1株能够高效降解苯酚的菌株,命名为HNGCXY.1.该菌株可以在以苯酚为惟一碳源和能源的无机培养基上生长,能够耐受最高浓度为1 000 mg/L的苯酚.对该菌株的降解性能研究表明:该菌株具有较强的苯酚降解能力,在温度为28～32℃,pH值为6.5～7.5,摇床振荡速度大于160 r/min,苯酚浓度为600 mg/L的条件下,单位时间内对苯酚的降解能力最强.根据其生理生化特性和16S rDNA序列同源性分析结果,将其初步鉴定为产碱杆菌(Alcaligenes sp.).【总页数】4页(P69-72)【作者】崔树军;金维平;张建云;陈红歌;张庆甫【作者单位】河南工程学院,资源与环境工程系,河南,郑州,451191;河南工程学院,资源与环境工程系,河南,郑州,451191;河南工程学院,资源与环境工程系,河南,郑州,451191;河南农业大学,生命科学学院,河南,郑州,450002;河南工程学院,资源与环境工程系,河南,郑州,451191【正文语种】中文【中图分类】X53【相关文献】1.石油污染土壤中高效苯酚降解菌的分离鉴定及特性研究 [J], 岳黎;唐赟;杨艳;刘亮;宋嫣;谭洪;王晓玉2.一株苯酚降解菌分离及降解特性研究 [J], 杨世东;孔龙;廖路花;陶文鑫;姚丽强;张星楠3.一株耐盐苯酚降解菌的分离、鉴定及特性研究 [J], 曲媛媛;周豪;王平;汲广欣;周集体4.一株嗜热菌的分离鉴定及其苯酚降解特性 [J], 唐赟;刘沐之;梁凤来;冯露;刘如林5.一株高效苯酚降解菌的分离、鉴定及降解特性的研究 [J], 龚斌;刘津;赵斌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
苯酚降解菌的分离鉴定及降解特性的初步研究
菌 ，研究 了其 生长 条件 及降 解特 性 ，可为 工业 化生 物处理 含 苯酚类 污染 物提 供理 论依据 。
１ 试验 材 料 及 方 法
１ １ 材 料 ．
ｉ ）菌株 来源 取 荆州 市 沙隆达 农药 厂 排污 口处 的污泥 作 为试验 的原始 菌 液 。 ２ ）培 养 基 ① 选 择 培 养 基 （ 机 盐 培 养 基 ） ：ＮＨ ＮＯ．１０ ，Ｃ Ｃ ０ ｉ ， Ｋ ＨＰ ０ ５ ， 无 ］ ． ． ｇ ａ １ ．ｇ 。 Ｏ ． ｇ
按 上述方法 培养 驯化 ，苯 酚浓 度增 加 至 １ ５ ． ｇ Ｌ。 ． 、２ ０ ／
将含 ２ ５／ ．Ｏ ／： ｍｌ ０ 含 ． ｇ Ｉ苯酚的新 鲜选 择培养基 中 ，重复上 述培养
驯化 ，至苯酚浓度达 到 ２ Ｏ ／ ．ｇ Ｉ ，完成 １ 个驯 化周期 。共进行 ３个驯化周期 ，得到耐 高浓度苯酚的 菌种 。
苯 酚 降解 菌 的分 离鉴 定 及 降解 特 性 的初 步研 究
马 立 安 ，石 磊 （ 长江大学生命科学学院， 北 荆州 ４４２） 湖 ３０ ３
［ 要 ］ 为 了 筛选 高 效 降解 苯 酚 的微 生 物 ， 为 工 业 化 生 物 处 理 受 苯 酚 类 污 染 的 工 业 废 水及 污 染 物提 供理 论 摘
维普资讯
长 江 大学 学 报 （ 自科 版 ）理 工 卷 ２０ 年 １ 月 第 ４ 第 ４ ０７ ２ 卷 期 Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆ ａ ｇｚ ｎｖｒｉ Ｎ ｔ ｃ Ｅ ｉ ｃ ｏ ｒ ａ ｏ ｎ ｔ Ｕ ｉｅｓ ｙ（ ａ Ｓ ｉ ｄｔ ｉ＆ Ｅ ｇ Ｖ Ｄ ｃ ２ ０ ．Ｖ １ ・ Ｙ ｅ ｔ ）Ｓ ｎ ｅ． ０ ７ ｏ． Ｎｏ ４ ４
１ ２ 方 法 ．
１ ）选择增 茵与驯化
高效苯酚降解菌Bacillus sp. L5-1的分离及其降解特性
中国环境科学 2021,41(5)：2441~2448 China Environmental Science 高效苯酚降解菌Bacillus sp. L5-1的分离及其降解特性刘庆辉,李剑*,杨航,王志宇,李艳,张玮川,贾银娟,张秋根,罗旭彪(南昌航空大学,重金属污染物控制与资源化国家地方联合工程研究中心,江西南昌 330063)摘要：从污水处理厂活性污泥中分离筛选出一株高效苯酚降解菌L5-1,经菌落形态观察和16S rDNA基因测序,结果表明菌株L5-1为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus),美国国家生物信息中心(NCBI)的注册号为MN784421.将苯酚设置为唯一碳源,对其生长和苯酚降解特性展开研究.结果表明: 菌株L5-1在10%接种量、温度30~35℃、pH值7~8的条件下,均能高效降解培养基中苯酚(培养基体积为100mL,初始苯酚浓度为500mg/L,14h时降解率>93%).而在最优降解条件下(10%接种量,培养温度为35,pH℃值7.0,NaCl浓度为1%),初始苯酚浓度为500mg/L,菌株在14h内的苯酚降解率可达97.1%;而当初始苯酚浓度为1000mg/L,菌株也可在46h内达到97.71%的降解率.运用Haldance方程动力学模拟菌株在不同浓度苯酚下的生长过程,其最大比生长速率为0.355h-1,半饱合常数104.27mg/L,抑制常数为322.83mg/L,R2=0.997. 菌株L5-1为目前已报道的Bacillus菌属中降解苯酚能力较强的菌株,为实际处理含酚废水中提供理论参考.关键词：Bacillus cereus；苯酚；生物降解；动力学中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2021)05-2441-08Isolation and degradation characteristics of highly efficient phenol-degrading bacteria Bacillus sp. L5-1. LIU Qing-hui, LI Jian*, YANG Hang, WANG Zhi-yu, LI Yan, ZHANG Wei-chuan, JIA Yin-juan, ZHANG Qiu-gen, LUO Xu-biao (National-Local Joint Engineering Research Center of Heavy Metals Pollutants Control and Resource Utilization, Nanchang Hangkong University, Nanchang 330063, China). China Environmental Science, 2021,41(5)：2441~2448Abstract：A highly efficient phenol-degrading bacterium named L5-1 was isolated and screened from the activated sludge from a sewage treatment plant. The colony morphology observation and 16S rDNA gene sequencing showed that the strain L5-1 was Bacillus cereus, with the registration number of MN784421 in the US National Center for Biotechnology Information (NCBI). A series of experiments with Phenol as the only carbon source were conducted to study the growth and phenol degradation characteristics of this strain L5-1. The results showed that under the conditions of 10% inoculum, temperature range of 30 to 35℃, pH range of 7 to 8 , the strain L5-1 effectively degraded phenol in the culture medium (with the 100mL of medium volume and the initial phenol concentration of 500mg/L), the degradation rate was better than 93% in 14h. Under optimal degradation conditions (10% inoculum, culture temperature at 35℃, pH 7.0, and NaCl concentration at 1%), The phenol degradation rate reached 97.1% within 14 hours when the initial concentration was set at 500mg/L. When the initial phenol concentration was set to 1000mg/L, the strain L5-1 still reached 97.71% degradation rate within 46 hours. The Haldane kinetic model was used to simulate the growth process of strains under different concentrations of phenol. The maximum specific growth rate was 0.355h-1, the semi-saturation constant was 104.27mg/L, the inhibition constant was 322.83mg/L, R2=0.997. This study confirmed Strain L5-1 was a Bacillus strains with strong phenol degradation ability among the reported strains of the genus Bacillus, and provided certain theoretical references for the actual treatment of phenol-containing wastewater.Key words：Bacillus cereus；phenol；biodegradable；kinetics苯酚污染废水是一种典型的高毒性工业废水,是纺织加工、煤炭气化、石油精炼、皮革制造、树脂合成、医药制造、香料生产、合成纤维等许多工业过程中常见的有机污染物[1].并且苯酚具有很强的流动性,在浓度很低时(1mg/L)也能快速渗透到周围生态环境中,导致水体有难闻的气味和味道,对动植物有长效性和生物积累性[2].美国和中国也先后将苯酚列入首批水中优先控制污染物名单[3].目前含酚废水的处理方法主要有物理法、化学法和生物法.利用生物法替代物理化学法矿化废水中的苯酚具有成本低、效率高等特点,且降解后的最终产物多为环境无害物质,如低碳化合物,二氧化碳和水[4-5].因此,利用生物法处理含酚废水受到广泛关注.近年来,国内外学者就如何利用微生物降解苯收稿日期：2020-09-25基金项目：国家自然科学基金资助项目(21467018);江西省教育厅项目(GJJ170576);江西省重点研发计划项目(20181ACG70021)* 责任作者, 副教授,***************.cn2442 中国环境科学 41卷酚污染废水进行了大量的研究, 筛选出多种菌株,有根瘤菌(rhizobia)[6]、不动杆菌如Acinetobacter calcoaceticus[7]和Acinetobacter sp.AQ5NOL 1[8]、红球菌如Rhodococcus erythropolis[9]和Rhodococcus spp.CM-HZX1[10]、产碱杆菌(Alcaligenes sp.)[11]等.其中有许多能降解高浓度苯酚并具有良好耐受性的微生物,如Jiang等[12]从湖北某药厂的生物池中分离出Candida genus,能在72h内降解800mg/L苯酚.陈晓华等[13]从北京一处人工湿地分离出的Ochrobactrum sp.可耐受1300mg/L苯酚并在48h内对1000mg/L苯酚降解率达到82.2%,王图锦等[14]从一个焦化厂受污染的土壤中分离出不动杆菌,能在60h内完全降解初始浓度1200mg/L苯酚. Shourian 等[15]从制药处理废水中分离出的Pseudomonas sp.能在85h内降解1000mg/L苯酚.在目前发现的众多苯酚降解菌中,有不少研究报道Bacillus菌属能有效降解苯酚. Bacillus thuringiensis J20 在120h内对700mg/L的苯酚降解率为88.6%[16],Bacillus brevis 降解1000mg/L苯酚需132h[17].其中Bacillus cereus 降解废水中苯酚的研究较少,苯酚降解效率也较低,菌株Bacillus cereus F6在8h内仅能降解100mg/L 苯酚[18],Bacillus cereus B3降解800mg/L的苯酚需72h[19].本文取江西南昌象湖污水处理厂的曝气池活性污泥,在实验室模拟工业含酚废水逐步驯化苯酚降解菌,筛选出一株对高浓度苯酚耐受并且降解效果优异的菌株L5-1,探讨了培养条件(接种量、温度、pH值、盐度、初始苯酚浓度)对L5-1生长及苯酚降解的影响.并将实验数据与Haldance方程动力学模型相拟合,探究了菌株生长和初始苯酚浓度之间的关系,以期为微生物处理苯酚污染废水提供理论参考.1材料与方法1.1菌种的来源本研究用来分离筛选菌株的样品取自江西南昌象湖污水厂曝气池活性污泥(黑色絮状).1.2培养基的制备无机盐培养基(g/L):NH4NO31.50,KH2PO4 1.50, K2HPO4 1.2, NaCl 5.00, MgSO4 0.06, MnSO4 0.02, H3BO3 0.02,ZnSO4.7H2O 0.03, FeSO4 0.05,通过1mol/L的NaOH和HCl调节pH值.定容至指定体积后灭菌备用.富集培养基(g/L):牛肉浸膏4,蛋白胨8,NaCl 4.定容至指定体积后灭菌备用.固体培养基:在已配好的液体培养基中加入1.8%(质量分数)的琼脂粉制成固体培养基,经高压灭菌锅中灭菌后倒入无菌培养皿冷却备用.1.3菌种的富集与驯化将适量活性污泥加入到100mL无菌生理盐水中,在30,150r℃/min下充分振荡1h,取10%体积的菌液,在无菌环境下接种到灭菌后的富集培养基中.在30,150r℃/min下培养到对数增长期后,取10mL富集菌液接种到90mL的无机盐培养基中,并添加苯酚作为唯一碳源.在同样的培养条件下重复此操作,以100mg/L为增加量逐步提升苯酚浓度至1000mg/L.选择生长较好的培养基进行下一步实验.1.4苯酚降解菌的筛选与纯化用无菌水将培养至对数期的菌液稀释成不同浓度梯度.在无菌环境下均匀地涂布在固体培养基表面.在恒温培养箱中倒置培养,定时观察,挑取形态及大小、颜色不同的单一菌落,于事先配置好的300mg/L苯酚的固体无机盐培养基上划线,得到单一纯菌.将分离的单一纯菌富集培养至OD600为1.0左右,作为接种体备用.以10%(体积比)的接种量加入到无机盐培养基中,添加苯酚作为唯一碳源.在30℃、150r/min,以相同条件下没有加入菌液但添加了相同浓度苯酚的无机盐培养基作为对照组,通过定时检测各培养基的苯酚浓度选择出降解效果最好的菌株,最后再反复划线确保得到单株菌种.并用斜面低温保存.1.5菌株生长和苯酚降解率的测定细菌生长量的测定:采用不含菌液的无机盐培养基作为对照参比,在波长600nm处测定菌种吸光值(OD600).代入公式(1)计算菌体质量浓度(DCW)[19].600DCW(mg/L)314.5OD=× (1) 苯酚浓度采用4-氨基替比林法测定苯酚浓度[20],代入公式(2)计算培养基苯酚降解率(%)100%=−×苯酚降解率初始苯酚度微生物浓处浓浓理后苯酚度初始苯酚度(2)1.6菌株的鉴定及系统发育树的构建5期 刘庆辉等：高效苯酚降解菌Bacillus sp. L5-1的分离及其降解特性 24431.6.1 形态学及生理生化鉴定 将菌株接种于固体培养基中观察其菌落形态,采用扫描电镜(SU1510)在10000倍下观察菌株L5-1的表面形态.测定菌株革兰氏染色、好氧性等生理生化指标.1.6.2 16S rDNA 序列分析 将要鉴定的菌株在固体培养基中划线培养至对数期后,用试剂盒(上海生工)提取分离出菌株L5-1的基因组DNA,采用细菌通用引物27F 和反向引物1492R 扩增反应DNA 序列[21].将产物电泳检测后进行测序分析(上海生工).测序结果在BLAST 和MEGA4.1软件中进行基因库比对分析和以邻位相接法构建系统发育树,初步获得菌株的生物学分类地位. 1.7 菌株生长及降解苯酚特性以不同体积比的接种量(6%、8%、10%、12%、14%)、不同培养温度(15, 20, 25, 30, 35, 40, 45℃)、不同pH 值(4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)、不同NaCl 浓度(0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%)在体积为100mL,初始苯酚浓度为500mg/L 的无机盐培养基中进行单因素试验,在150r/min 的振荡培养箱中培养, 间隔1h 取一次样,测定培养基中生物量和苯酚降解率,确认其最适宜的苯酚降解条件.菌株在不同初始苯酚浓度下的降解:根据以上试验确定的最佳接种量、温度、pH 值以及NaCl 浓度接种于不同初始苯酚浓度(200~1400mg/L)的无机盐培养基中,在150r/min 的培养箱中间隔2h 取一次样,测定培养基中的生物量和苯酚含量.以上试验均重复3次.1.8 苯酚降解动力学分析在微生物降解苯酚的过程中,降解底物苯酚既作为微生物的唯一碳源,又因为其毒性会对微生物生长产生抑制作用[22].因此本研究采用Haldane 方程来描述初始苯酚浓度对菌株L5-1生长的影响[23], 如公式(3)所示max phenol2phenolphenol =s iC C K C K µµ++(3)式中: µ为微生物比生长速率, h -1;µmax 为最大比生长速率, h -1;C phenol 为苯酚质量浓度, mg/L ;K s 为半饱和常数, mg/L;K i 为抑制常数, mg/L.并用Origin8.0将实验数据与动力学方程拟合. 2 结果与讨论2.1 苯酚降解菌的筛选与鉴定图1 菌株L5-1的扫描电镜图Fig.1 Scanning electron micrograph of strain L5-1×10000图2 菌株L5-1的16S rDNA 序列进化树Fig.2 The 16S rDNA sequence phylogenetic tree of strain L5-12444 中国环境科学 41卷通过多次富集驯化和分离纯化后,本研究得到4株对高浓度苯酚具有较高降解效果且能够良好生长的菌株,其中一株菌株具有良好的苯酚耐受性以及高效的苯酚降解率,将该菌株命名为L5-1,观察其菌落形态和部分生理生化特征,结合16S rDNA鉴定其菌种.经观测,L5-1菌落形态为白色,圆形,不透明,表面粗糙.革兰氏染色呈红色,为革兰氏阳性菌.进行琼脂柱穿刺实验发现其为兼性好氧菌.扫描电镜(10000×)结果如图1所示,可以看出菌体为杆状,表面较为平整,不透明,大小在1.5~2µm左右,且生长状况良好.测定16Sr DNA核酸序列,并将序列在GenBank 数据库中作比对分析,构建了菌株L5-1与其他相近菌株之间的系统发育关系(图2).结果显示菌株L5-1与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus. MH19)相似性为99.6%,根据同源性分析结果,该菌株归属于Bacillus sp.,鉴定结果为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus).该菌株的基因序列已提交至NCBI基因库,其注册号为MN784421.2.2接种量对菌株L5-1降解苯酚的影响图3 不同接种量对菌株L5-1降解苯酚的影响Fig.3 Effect of different inoculation amount on phenoldegradation by Strain L5-1接种量的多少会对菌株降解苯酚产生直接影响,接种量过少会导致菌株更容易受到苯酚的抑制作用,接种量过高则会增加投入成本,会造成菌株之间对碳源的竞争,影响降解效果.如图3所示,接种量为6%菌液时,培养基中菌株在14h内对500mg/L苯酚的降解率为74.4%,菌株降解苯酚的停滞期随着接种量的增高而明显缩短,培养基中苯酚的浓度也在不断降低,接种量为10%、12%时,在14h内培养基中浓度为500mg/L的苯酚均被完全降解,接种量为14%时,在14h内培养基中苯酚降解率为96.8%.说明适当的提高接种量是提升菌株降解苯酚效果的一种有效途径.可以看出接种量超过10%时菌株对苯酚的降解效果提升不明显,接种量过大时反而影响到菌株的降解效果,且会增加经济成本,综合考虑选择10%作为菌株L5-1的最佳接种量.2.3温度对菌株L5-1生长和降解苯酚的影响温度是影响微生物生长繁殖的重要因素,选择出合适的温度能有效提高微生物酶活性,有助于提升参与苯酚降解的酶促反应速率[23].从图4中可以看出,菌株L5-1的最佳生长和降解苯酚温度为35,℃并在30~35℃之间对500mg/L苯酚在14h的降解率都大于95%(30℃为95.4%,35℃为96.9%),且生长状况良好.该菌株具有典型的嗜中温特点,培养温度在15和45℃时生物量和降解率都达到最低(15℃时降解率19.7%,45℃时降解率24.6%).这可能是因为培养温度过低会使参与酚类降解的微生物酶活性降低,细菌新陈代谢速率变慢,温度过高则容易让微生物酶失去活性[24].OD60图4 温度对菌株L5-1生长及苯酚降解的影响Fig.4 The effect of temperature on the growth of strainL5-1and degradation of phenol初始苯酚浓度500mg/L,14h2.4pH值对菌株L5-1生长和降解苯酚的影响如图5所示,菌株L5-1的最佳生长和降解苯酚pH值为7.0,14h内对500mg/L苯酚降解率为97%,培养基中pH值低于7.0后,随着pH值的下降菌株对苯酚的降解率逐渐下降,当培养基中pH值为4.05期 刘庆辉等：高效苯酚降解菌Bacillus sp. L5-1的分离及其降解特性 2445时,菌株基本不生长.当pH 值超过7.0后,菌株在碱性条件下对苯酚的降解率和生长状况相比酸性条件下有明显提高(pH 值为5.0时31.3%,pH 值为6.0时70.6%,pH 值为8.0时93.4%,pH 值为9.0时61.7%,pH 值为10.0时7.8%).这是因为苯酚在降解过程中会产如己二酸、丙酮酸等有机酸,致使培养基的pH 值逐渐降低,所以中性和偏碱性环境相比酸性环境更有利于菌株降解苯酚[25-26].并且在偏酸和偏碱的条件下,菌株L5-1的生长和苯酚降解效率都明显下降.这可能由于pH 值影响到了微生物的生长和代谢,进而影响到微生物对培养基中营养物质的吸收和苯酚的降解[27].在pH 值为6.0~9.0条件下,菌株L5-1在14h 内对苯酚的降解率都大于60%,表面菌株L5-1对pH 值有良好的耐受范围且该菌株更耐碱性环境.O D600pH 值图5 pH 值对菌株L5-1生长及苯酚降解的影响 Fig.5 Effect of pH on the growth of strain L5-1 anddegradation of phenol初始苯酚浓度500mg/L,14h2.5 NaCl 对菌株L5-1生长和降解苯酚的影响在工业废水的排放过程中,除了高浓度含酚污染物之外,通常还含有大量盐分,过高的盐分会抑制菌株的生长且对微生物有一定的毒害作用[28].如图6所示,菌株最适宜NaCl 浓度为1%.当NaCl 浓度在2%~6%范围内时,菌株L5-1和苯酚降解率在68h 内对500mg/L 苯酚降解率都为97%左右,当培养基中NaCl 浓度超过6%时,菌株的生长和苯酚降解随着NaCl 浓度的升高而明显受到抑制.当培养基中NaCl 浓度增加至10%时,菌株L5-1的生长量和苯酚降解率仍达到0.58和62.7%,表明菌株对盐浓度有很好的耐受性.王丽娟等[29]发现Bacillus ZU -R6在5%的盐度下降解500mg/L 苯酚,72h 时内降解率仅在50%左右,在8%的盐度下降解500mg/L 苯酚,72h 时降解率仅在20%左右.黄中子等[30]发现一株Virgibacillu sp.在5%的盐度下降解500mg/L 苯酚,72h 内的去除率达98%.因此,菌株L5-1与现有的菌株相比具有较宽的盐浓度适应范围和较快的降解速率,在处理含盐苯酚废水中有一定的优势.O D600图6 NaCl 浓度对菌株L5-1生长及苯酚降解的影响 Fig.6 Effect of NaCl concentration on the growth of strainL5-1 and degradation of phenol初始苯酚浓度500mg/L,68h2.6 菌株生长与苯酚的降解菌株L5-1在最佳降解条件下(10%的接种量、温度为35℃、pH 值为7.0、NaCl 浓度为1%)接种至初始苯酚浓度为500mg/L 的无机盐培养基中,其随时间的生长与苯酚降解曲线如图7所示.O D600图7 最佳条件下菌株L5-1的生长及苯酚降解曲线 Fig.7 Growth and phenol degradation curve of strain L5-1under optimal conditions 500mg/L由图7可知,L5-1经历了近4h 的停滞期,在此期2446 中国环境科学 41卷间苯酚浓度下降缓慢,5~9h进入对数生长期,细菌数量增长极其迅速,苯酚含量随着细菌数量的增加而迅速下降,并在接种13h后达到静止期,此时培养基中细菌总数达到最大,其OD600值为0.93.到14h时,对500mg/L苯酚的降解率达到97.1%.2.7初始苯酚浓度对降解率的影响菌株在不同初始苯酚浓度下,苯酚浓度随时间降解效果如图8所示.当初始苯酚浓度为200mg/L时,在6h内苯酚降解率达到89%.46h对1000mg/L苯酚的降解率达到97.71%.随着初始苯酚浓度的提高,菌株的停滞期也相应的增加,菌株降解相同含量的苯酚所需的时间逐渐延长.当初始苯酚浓度为1200mg/L时,66h才将培养基中苯酚浓度降解到32mg/L左右,降解率为97.4%.而当初始苯酚浓度为1400mg/L时,苯酚66h内的降解率仅为29.0%,由此可见,高浓度苯酚对菌株L5-1的生长有强烈的抑制或毒害作用,使得菌株降解苯酚速率变得尤为缓慢.图8 不同初始苯酚浓度对菌株L5-1降解苯酚的影响Fig.8 Degradation of phenol by strain L5-1 at different initialconcentrations of phenol2.8菌株L5-1对苯酚的降解动力学研究将微生物比生长速率和苯酚初始质量浓度通过非线性最小二乘法按照方程拟合(图9),方程动力学参数为:µmax=0.355h-1,K s=104.27mg/L,K i为322.83mg/L,降解苯酚最适浓度为183.78mg/L.实验数据与模型拟合吻合良好,相关系数R2为0.997.结果表明,苯酚是一种抑制底物,初始苯酚浓度低于183.78mg/L时,菌株L5-1的比生长速率与初始苯酚浓度成正比关系,这是因为培养基中降解菌缺乏足够的碳源供其生长,此时培养基中底物的浓度对菌株的生长速率起主导作用.初始苯酚浓度高于183.78mg/L时,菌株L5-1的比生长速率成负相关,此时初始苯酚浓度的升高使其对菌株抑制作用逐渐增强.表1中为目前已报道的几种微生物苯酚降解动力学参数,其中µmax表示最大比生长速率,K s饱和常数大小表示菌株对苯酚的亲和性,K s越小表示菌株对苯酚的亲和性越大,菌株的比生长速率也就更快, K i抑制常数则表示苯酚对菌株的抑制强度和毒害大小,K i值越大,苯酚对菌株的抑制和毒害作用也就越小,菌株耐受苯酚程度就越大[22].由表可以看出,菌株L5-1比较于其它苯酚降解菌的最大比生长速率和饱和常数相差不大,属于一般水平,其抑制常数大于Ochrobactrum sp.CH10[13]、波茨坦短芽孢杆菌[22]和Trichosporo n.sp[31]等其它苯酚降解菌,说明菌株L5-1具有良好的苯酚耐受能力.表1不同微生物的苯酚降解动力学Haldhance方程参数Table 1 Haldhance equation parameters of phenol degradation kinetics of different microorganisms菌种µmax(h-1) K s(mg/L) K i(mg/L)R2 Bacillus sp.L5-1(本文) 0.355 104.27 322.83 0.997 Ochrobactrum sp. CH10[13]0.441 77.77 110.6 0.973 Brevibacillus borstelensis[22]0.334 14.07 196.89 0.992 Halomonas sp. H17[23] 0.31 191.63 683.050.997Trichosporon.sp[31] 0.667 51.14 271.70.997Alcaligenes faecalis[32] 0.150 22.20 245.40 0.987图9 菌株L5-1苯酚降解动力学Fig.9 Kinetics of degradation of phenol by strain L5-13结论3.1从污水处理厂活性污泥中分离出一株苯酚降5期刘庆辉等：高效苯酚降解菌Bacillus sp. L5-1的分离及其降解特性 2447解菌.鉴定分析为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),命名为L5-1.该菌株对苯酚具有高效的降解能力.其中最佳降解条件是接种量为10%,生长温度为35,pH℃值7.0,NaCl浓度为1%.3.2菌株降解不同初始浓度苯酚动力学与Haldance模型吻合良好,经拟合其生长参数为µmax= 0.355h-1,K s=104.27mg/L,K i=322.83mg/L.相关性系数(R2)为0.997.3.3该菌株相比于其他Bacillus cereus降酚菌株具有较宽的环境适应范围和更高的降解效率,14h对500mg/L苯酚的降解率达到97.71%,46h对1000mg/L苯酚的降解率达到97.7%.因此,该菌株在含酚废水的生物降解领域有极大的应用潜力.参考文献：[1] Mao Z, Yu C, Xin L. Enhancement of phenol biodegradation byPseudochrobactrum sp. through ultraviolet-induced mutation [J].International Journal of Molecular Sciences. 2015,16(12):7320-7333. [2] Massalha N, Shaviv A, Sabbah I. Modeling the effect ofimmobilization of microorganisms on the rate of biodegradation of phenol under inhibitory conditions [J]. Water Research, 2010,44(18): 5252-5259.[3] 王兵,刘璞真,任宏洋,等.非均相催化臭氧化降解水中苯酚动力学[J]. 环境工程学报, 2016,10(7):3427-3433.Wang B, Liu P Z, Ren H Y, et al. Degradation kinetics of catalytic ozone oxidation of phenol in water [J]. Chinese Journal of Environmental Engineering. 2016,10(7):3427-3433.[4] 陈治希,刘昭文,杨凯,等.微生物降解酚类污染物的研究进展 [J].广州化学, 2015,40(1):72-78.Chen Z X, Liu Z W, Yang K, et al. Progress of phenolic compounds degradation by microbes [J].Guangzhou Chemistry, 2015,40(1):72-78.[5] Lu Z, Guo X, Li H, et al. High-throughput screening for a moderatelyhalophilic phenol-degrading strain and its salt tolerance response [J].International Journal of Molecular Sciences. 2015,16(12):11834- 11848.[6] Wei G H, Yu J F, Zhu Y H, et al. Characterization of phenoldegradation by Rhizobium sp. CCNWTB 701isolated from Astragalus chrysopteru in mining tailing region [J]. Journal of Hazardous Materials, 2008,151(1):111-117.[7] 陈明,张维,徐玉泉,等.醋酸钙不动杆菌PHEA-2对苯酚的降解特性研究 [J]. 中国环境科学, 2001,21(3):226-229.Chen M, Zhang W, Xu Y Q, et al. Study on characteristics of Acinetobater calcoaceticus PHEA-2 for phenol degradation [J]. China Environmental Science, 2001,21(3):226-229.[8] Ahmad S A, Shamaan N A, Arif N M, et al. Enhanced phenoldegradation by immobilized Acinetobacter sp. strain AQ5N OL 1[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2012,28(1): 347-352.[9] 刘艳霞.降酚菌的定向驯化及其对含酚废水的降解作用 [D]. 北京:北京化工大学, 2011.Liu Y X. The teaming of phenol-degraded bacteria and its biodegradability to phenolic wasterwater [D]. Beijing: Beijing University of Chemical Technology, 2011.[10] 魏霞,周俊利,谢柳,等.苯酚降解菌CM-HZX1菌株的分离、鉴定及降解性能研究 [J]. 环境科学学报, 2016,36(9):3193-3199.Wei X, Zhou J L, Xie L, et al. Isolation, identification and characterization of phenol-degrading strain CM-HZX1 [J]. Acta Scientiae Circumstantiae. 2016,36(9):3193-3199.[11] 徐庆.苯系物降解菌的筛选及其降解特性研究 [D]. 曲阜:曲阜师范大学, 2017.Xu Q, Screening of benzene series degradation bacteria and study on their degradation characteristics [D]. Qufu: Qufu Normal University. [12] Jiang Y, Yang K, Wang H, et al. Characteristics of phenol degradationin saline conditions of a halophilic strain JS3 isolated from industrial activated sludge [J]. Marine Pollution Bulletin, 2015,99(1/2):230-234.[13] 陈晓华,魏刚,刘思远,等.高效降酚菌株Ochrobactrum sp. CH10生长动力学和苯酚降解特性的研究 [J]. 环境科学, 2012,33(11):3956- 3961.Xu X H, Wei G, Liu S Y, et al. Growth kinetics and phenol degradation of highly efficient phenol-degrading Ochrobactrum sp. CH10 [J].Environmental Science, 2012,33(11):3956-3961.[14] 王图锦,潘瑾,刘雪莲.高效苯酚降解菌PDB1的筛选及降解特性研究 [J]. 科学技术与工程, 2017,17(2):301-304.Wang T J, Pan J, Liu X L, et al. Breeding of Phenol-degradation Bacteria and Studyon Phenol Biodegradation by the Strain PDB1[J].Science Technology and Engineering, 2017,17(2):301-304.[15] Shourian M, N oghabi K A, Zahiri H S, et al. Efficient phenoldegradation by a newly characterized Pseudomonas sp. SA01 isolated from pharmaceutical wastewaters [J]. Desalination, 2009,246(1-3): 577-594.[16] Ereqat S I, Abdelkader A A, N asereddin A F, et al. Isolation andcharacterization of phenol degrading bacterium strain Bacillus thuringiensis J20 from olive waste in Palestine [J]. Journal of Environmental Science and Health, Part A. 2018,53(1):39-45.[17] Arutchelvan V, Kanakasabai V, Elangovan R, et al. Kinetics of highstrength phenol degradation using Bacillus brevis [J]. Journal of Hazardous Materials. 2006,129(1-3):216-222.[18] 刘鸿杰,何熙璞,李浩,等.苯酚降解菌F6的筛选鉴定及降解特性[J]. 基因组学与应用生物学, 2017,36(1):233-238.Liu H J, He X P, Li H, et al. Isolation and identification of phenol degradation strain F6 and its degradation characteristic [J]. Genomics and Applied Biology, 2017,36(1):233-238.[19] 于彩虹,陈飞,胡琳娜,等.一株苯酚降解菌的筛选及降解动力学特性 [J]. 环境工程学报, 2014,8(3):1215-1220.Yu C H, Chen F, Hu L N, et al. Selection of phenol degradation bacteria and characteristic of degradation kinetics [J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2014,8(3):1215-1220.[20] HJ 503-2009 水质水中挥发酚类测定4-氨基安替比林分光光度法 [S].HJ 503-2009 Water quality-ddetrmination of volatile phenolic compounds-4-AAP spectrophotometric method [S].[21] 冯玉雪,毛缜,吕蒙蒙.一株DDT降解菌的筛选及其降解特性 [J].2448 中国环境科学 41卷中国环境科学, 2018,38(5):1935-1942.Feng Y X, Mao Z, Lv M M. Screening and degradation characteristics of a DDT-degrading bacteria [J]. China Environmental Science, 2018,38(5):1935-1942.[22] 葛启隆,王国英,岳秀萍.波茨坦短芽孢杆菌降解苯酚特性及动力学研究 [J]. 生物技术通报, 2014,(3):117-122.Ge Q L, Wang G Y, Yue X P. Phenol degradation by Brevibacillus borstelensis and kinetic analysis [J]. Biotechnology Bulletin, 2014,(3):117-122.[23] 赵娜娜,许继飞,宋晓雪,等.嗜盐高效降酚菌株Halomonas sp. H17的筛选及降解苯酚特性 [J]. 环境科学学报, 2019,39(2):318-324.Zhao N N, Xu J F, Song X X, et al. Screening and phenol-degrading characteristics of a highly efficient phenoldegrading halophilic bacterial strain Halomonas sp.H17 [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2019,39(2):318-324.[24] Levén L, N yberg K, Schnürer A. Conversion of phenols duringanaerobic digestion of organic solid waste – A review of important microorganisms and impact of temperature [J]. Journal of Environmental Management, 2012,95(1):S99-S103.[25] Kuang Y, Zhou Y, Chen Z L, et al. Impact of Fe and N i/Fenanoparticles on biodegradation of phenol by the strain Bacillus fusiformis (BFN) at various pH values [J]. Bioresource Technology, 2013,136(Complete):588-594.[26] 张安龙,王晔,王雪青,等.一株高效苯酚降解真菌的分离鉴定及其菌剂的制备 [J]. 微生物学通报, 2018,45(7):1450-1461.Zhang A L, Wang Y, Wang X Q, et al. Isolation and identification of a high-efficiency phenol-degrading fungi and the preparation of its microbial inoculum [J]. Microbiology China, 2018,45(7):1450-1461. [27] 张立国,刘建忠,班巧英,等.弱酸性条件下丙酸富集培养物的降解特性 [J]. 中国环境科学, 2016,36(12):3724-3728.Zhang L G, Liu J Z, Ban Q Y, et al. Degradation characteristics of a propionate enriched culture at slightly acidic conditions [J]. China Environmental Science, 2016,36(12):3724-3728.[28] Li H, Meng F, Duan W, et al. Biodegradation of phenol in saline orhypersaline environments by bacteria: A review [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2019,184:109658.[29] 王丽娟,钱子雯,沈海波,等.一株耐盐菌的分离及其降解特性 [J]. 化工进展, 2017,36(3):1047-1051.Wang L J, Qian Z W, Shen H B, et al. Separation and biodegradation characteristics of a halotolerant strain [J]. Chemical Industry and Engineering Progress, 2017,36(3):1047-1051.[30] 黄中子,李辉,刘勇弟,等.一株中度嗜盐菌Virgibacillu sp.PDB-F2对苯酚的降解特性 [J]. 环境科学与技术, 2015,38(12):1-5.Huang Z Z, Li H, Liu Y D, et al. Characteristics of phenol biodegradation by a moderately halophilic bacterium Virgibacillu sp.PDB-F2 [J]. Environmental Science & Technology, 2015,38(12):1-5. [31] 马溪平,艾娇,徐成斌,等.耐低温苯酚降解菌的降解动力学研究[J]. 环境保护科学, 2009,35(5):18-21.Ma X P, Ai J, Xu C B, et al. Study on kinetics of phenol biodegradation by low temperature- resistance strain [J].Environmental Protection Science, 2009,35(5):18-21.[32] Jiang Y, Wen J, Bai J, et al. Biodegradation of phenol at high initialconcentration by Alcaligenes faecalis [J]. Journal of Hazardous Materials, 2007,147(1/2):672-676.作者简介：刘庆辉(1998-),男,江西吉安人,南昌航空大学硕士研究生,主要从事挥发性有机物的生物降解研究.。
苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究
上海师范大学硕士学位论文苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究姓名：何小丽申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：肖明20090501上海师范大学硕士学位论文摘要论文题目：苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究学校专业：微生物学学位申请人：何小丽指导教师：肖明摘要酚类化合物为细胞原浆毒物，属高毒性物质。
这类物质来源广泛，通常污染水源，毒死鱼虾，危害农作物，并严重威胁人类的健康。
含酚有机物的毒性还在于其只能被少数的微生物分解。
从自然界中筛选分离出能够降解特定污染物的高效菌种，有针对性的投加到已有的污水处理系统中的生物强化技术，能够快速提供大量具有特殊作用的微生物，在有毒有害污染物治理中显示出巨大的潜力。
1、本研究从胜利油田河口采油厂的飞雁滩油田土壤样品中分离得到10株能够利用并降解苯酚的菌株P1-P4、P7、P9-P13。
该10株苯酚降解菌能够在以苯酚为唯一碳源和能源的培养基上生长，经16S rDNA分子鉴定和生理生化检测，该10株降酚菌分别被鉴定到属或种。
其中降酚菌株P1、P3和P4这3株菌株分别属于劳尔氏菌属(Ralstonia)、贪噬菌属（Variovorax）和节杆菌属（Arthrobacter）里的种。
其它7株降酚菌株P2、P7、P9-P13都属于假单胞菌属（Pseudomonas）里的种。
这4个属里的细菌在国内外都已被报道有降解苯酚的特性，其中有关假单胞菌降解环境有机物的报道较多。
2、培养液中的苯酚含量通过4-氨基安替比啉分光光度法测定，通过苯酚降解效率的比较，菌株P2降解苯酚的能力较其它9株菌株要强。
于是将菌株P2作为本研究中进一步研究的对象，研究了不同的环境条件下该菌株降解苯酚和菌体生长的情况。
3、通过苯酚羟化酶特异性引物的设计，从菌株P2扩增出苯酚羟化酶大亚基基因，该基因片段编码对苯酚有催化活性的多肽，催化苯酚代谢的第一步反应；表明菌株P2能降解苯酚是由于细胞具有降解苯酚的遗传基础。
苯酚降解菌MW-1的分离及其降解特性研究
苯酚降解菌ＭＷ－1的分离及其降解特性研究摘要：用以苯酚为唯一碳源和能源的无机盐驯化液对沈阳某煤气厂土壤进行驯化培养。
从中分离筛选到1株苯酚降解菌。
编号为MW-1。
试菌株最高可耐受1600苯酚，其降解性能研究表明：该菌具有较强的苯酚降解能力。
在30。
C，pH5.5—7.5。
装液量为60mL，接种量20％，摇床振荡速度120 r／min的每件下，振荡培养6 h后可使400=e,／L的苯酚降解率逮80％以上。
虽然葡萄糖对该菌体的生长及降解苯酚均有一定的抑制作用。
但有葡萄糖(600 me／L)存在的情况下，该菌对苯酚的降解率仍接近60％。
这对处理含有其它碳源的含酚度水具有一定的意义。
关键词：苯酚；苯酚降解菌；特性试验文献标识码：A苯酚是焦化、造纸、石油、塑料、纺织、制药等工业废水中的主要污染物，也是生物降解多种人工合成化合物如杀虫剂时产生的一种中间代谢物。
大量酚类物质及其衍生物在土壤和水体中的排放和积累导致了生态环境的日趋恶化，许多国家已将其列入环境优先控制污染物的黑名单中。
近年来，国内外在苯酚生物降解方面进行了广泛的研究，已鉴定具有降解苯酚能力的微生物有细菌、酵母菌等。
利用培养优势菌群的微生物法降解酚类化合物因其投资少、处理效率高、运行成本低、无二次污染等优点而得到越来越广泛的应用。
本试验从沈阳某废弃煤气厂土壤中分离筛选到一株高效苯酚降解菌，并对其降解特性进行了研究，旨在找到对酚类化合物具有高效降解能力的优势菌株，为今后的进一步研究及含酚废水的生物处理奠定基础。
1材料与方法1.1菌种的来源沈阳某废弃煤气厂土壤1.2培养基驯化培养液：为无机盐溶液中添加一定浓度的苯酚配制而成。
各种无机盐的含量为(g／L)：NaO0.2；NH4.N03 1.0。
分离及保存培养基：为含200 m#L儿苯酚的牛肉膏蛋白胨固体培养基。
1.3苯酚降解菌的驯化、筛选与分离取一定量的菌源土壤加入到苯酚浓度为300mv／L的驯化培养液中,室温通气富集培养，定时取样测定苯酚浓度，至苯酚完全降解后，再加入新的以苯酚为唯一碳源的驯化培养液进行驯化培养。
高效苯酚降解菌的分离及降解性能的研究
高效苯酚降解菌的分离及降解性能的研究引言石油、化工、煤气、焦化及酚类等生产厂排放的废水当中含有大量的苯酚[1]。
未经净化的含酚废水可导致水源被污染，致使鱼类死亡，危害农作物，最终威胁人类的健康。
许多国家将苯酚列为重要的污染物之一。
目前，国内外处理含酚废水的方法主要有物理法、化学法、微生物法及各种结合法[2]。
其中微生物法主要利用微生物的代谢活动去除废水中的有毒物，处理方法无2次污染且安全、经济。
目前，已鉴定具有降解苯酚能力的微生物主要有假单胞菌（Pseudonomonas.sp）[3]、芽孢杆菌（Bacillus.sp）[4]、酵母菌（Yeast trichosporon）[5]、根瘤菌（Rhizobia）[6]、醋酸钙不动杆菌（A. calcoaceticus）[7]等，降酚菌株多存在于酚类污染物企业排放的废水、污泥和被废水污染的土壤中[8]。
本课题拟从被苯酚废水污染的污泥中进行菌株筛选，得到耐酚菌后在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养上筛选降酚菌株，进一步测定苯酚降解的影响因素。
对特定菌株降解含酚废水的应用价值进行研究。
1 实验材料和方法1.1 菌株来源采集原黑龙江省佳木斯东郊黑龙农药化工集团废弃排污口处污泥进行菌株筛选。
1.2 培养基基础培养基：NaCl 5.0g/L，蛋白胨10g/L，琼脂15～20g/L，酵母浸膏5.0g/L，调节pH为7.0。
以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基：CaCl2 0.1 g/L ，FeSO4.7H2O 0.01 g/L，K2HPO4 0.5g/L，MnSO4.7H2O 0.05 g/L，NaCl 0.2 g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4.H2O 0.01 g/L，NH4NO3 1.0 g/L苯酚按实验需要量添加，调节pH为7.0 [8]。
富集培养基：葡萄糖10.0g/L，营养琼脂33.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，调节pH为7.5。
1.3 研究内容与方法1.3.1 菌株和的驯化和分离在超净工作台中，将10mL含0.1g/L苯酚的基础培养基倒入培养皿，取10 g污泥加90mL蒸馏水搅拌15min，静置5min后取上层清液为菌原液[8]。
苯酚降解菌的筛选及其降解特性初探
Ｖ１７ 。 ｏ２ Ｎ． ． ４
Ａ ｇ２ １ ｕ．０ １
苯 酚 降解 菌 的 筛 选 及 其 降解 特 性 初 探
周倩倩 ， 丁 丛 ， 志平 ， 王 蔡伟 民
（ 上海交通大学 环境科 学与工程学 院 ， 上海 ２ ０４ ） ０ ２ ０
摘
要： 为深入 了解好氧颗粒污泥降解苯酚的 内在机 制 ， 用苯酚选择性培养基从 颗粒污泥 中筛选出 采
关键词 ： 生物 降解 ； 热带假 丝酵母 ； 苯酚 ； 降解特性
中图分 类号 ： １２ Ｘ ７ 文献标识码 ： Ａ 文章编 号 ：６２— ９ ６ ２ １ ）４— ５４— ６ １７ ０ ４ （０ １ ０ ０ ４ ０
பைடு நூலகம்
Ｉ ｏ ａ ｉ ｎ ｏ ｅ ｏ － ｅ ｒ ｄｉ ｇ ｓｒ ｉ ｎ ｒ ｌ ｉ ｒ ｓ ｌ ｔｏ ｆｐｈ ｎ ｌｄ ｇ ａ ｎ ｔ ａ ｎ ａ ｄ ｐ ｅｉ ｎａ ｙ ｍ
第２卷 第４ ７ 期
２ １ 年８月 ０ １
哈 尔 滨 商 业 大 学 学 报 （自然科 学版 ）
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆＨ ｒ ｉ ｎｖｒｉ ｆ ｏ ｏ ｒ ａ ｏ ａ ｂｎ Ｕ ｉｅｓ ｙｏ ｍｍｅｃ Ｎａｕ ａ Ｓ ｉｎ ｅ ｄｔ ｎ ｔ Ｃ ｒｅ（ ｔｒｌ ｃ ｃｓＥ ｉｏ ） ｅ ｉ
高效苯酚降解菌的筛选及其特性的研究
鉴定该菌为球 菌， 兰氏染色阴性 。 实验结果表 明 ： 革 降解苯 酚的最佳条件为 ： 温度 ３ 、 Ｈ值 ７ ８ 葡 萄糖 浓度 １５０ｍｇ 、 ０ｏ ｐ Ｃ ～， ０ ／ 接 Ｌ
种 量 ｌ％、 液 量 ５ Ｌ Ｏ 装 ０ｍ 。 关键词 ： 酚 ； 化 ； 苯 驯 筛选 ； 响 因素 影
文章 编 号 ：６ ４ １２ （０ ０ ０ — ０ ５ ０ １ ７— ０ １ ２ １ ）９ ０４ — ３
长所 需 的各种 营 养物 质 。实 际工 业含 酚废 水 中可 能 苯 酚是 一种 重要 的有 机化 工 原料 ，是 丙烯 的重
要 衍 生物 之 一 ， 要用 于 生 产 酚醛 树 脂 、 主 己内酰 胺 、 双 酚 Ａ、 己二 酸苯胺 以及 水杨 酸 等 …， 成 为这 些 工 并
ｄｏ ｅ１ ％ ，ｉ ｉ ｏ ｕ ｅ５ ｍ Ｌ ｓ ０ ｌｑｕ ｄｖ ｌ ｍ ０ Ｋｅ ｙ ｗｏｒ ｄｓ： ｈｅ ｏ ； ｃ ｌｍａｔ ａｉ ｎ ｓ ｒ ｅ ｎｇ ｆ ｃｏ ｓ ｐ ｎ ｌａ ｃ ｉ ｉ ｔｏ ； ｃ ｅ ｎｉ ； ａ ｔｒ ｚ
中 图分 类 号 Ａ
Ｋ２ ＨＰＯ４０． Ｌ， Ｓ ５ Ｍｇ Ｏ４‘ ７Ｈ２ ０． ／ Ｃａ ２０． ／ ０ ２ ｇ Ｌ， Ｃ１ １ ｇ Ｌ，
业废 水 中 的主要 污染 物 。 中国等 许多 国家 已将 其列
入重点污染物的名单之中［。 ２ 近年来 ， １ 国内外许多学 者在生物降解苯酚方面进行了广泛的研究 ，已筛选 出多种 降 酚微 生物 菌株 ， 如假 单 胞 菌 （ｓｕｏ ｏａ— Ｐｅｄｍ ｎｓ ｓ． 、 ｐ ） 真养 产碱菌 （ ａｉｅｅ ｕｒ ｈ ｓ …、 Ａｌ ｌ ｎ ｓ ｔ ｐ ｕ ） 醋酸 钙 ｃ ｇ ｅ ｏ
高效苯 酚降解菌 的筛选及其特性 的研究
实验三 高效苯酚降解菌的筛选及其性能测定
实验三高效苯酚降解菌的筛选及其性能测定一、实验目的1、掌握微生物分离纯化的基本操作；2、掌握用选择性培养基从环境中分离苯酚降解菌的原理和方法；3、掌握微生物对酚降解能力的测定方法；4、掌握4-氨基安替比林法测定苯酚含量的方法。
二、实验原理在工业废水的生物处理中，对污染成分单一的有毒废水，可以选育特定的高效菌株进行处理。
这些高效菌株以有机污染物作为其生长所需的能源、碳源或氮源，从而使有机污染物得以降解，具有处理效率高、耐受毒性强等优点。
苯酚是一种在自然条件下难降解的有机物，其长期残留于空气、水体、土壤中，会造成严重的环境污染，对人体、动物有较高毒性。
本实验通过筛选苯酚降解菌来处理含酚废水，将苯酚降解为为二氧化碳和水，消除对环境的污染。
+ COOHCH2CH2COOH CH3COOHCO2+H2O从环境中采样后，在以苯酚为唯一碳源的培养基中，经富集培养、分离纯化、降解实验和性能测定，可筛选出高效酚降解菌。
三、实验器材与试剂1、样品实验土样采自校园污水处理厂。
2、器材恒温培养箱、恒温摇床、分光光度计、比色皿、试管、250mL三角瓶、100mL 容量瓶、培养皿、涂布玻棒、量筒、天平、灭菌锅、酒精灯、接种环、棉花、棉线、牛皮纸、pH试纸。
3、试剂葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、苯酚、四硼酸钠（Na2B4O7）、4-氨基安替比林、过硫酸铵（（NH4）2S2O8）、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、琼脂。
苯酚标准溶液：称取分析纯苯酚1.0g，溶于蒸馏水中，稀释至1000mL，摇匀。
此溶液溶度为1000mg/L。
测定标准曲线时将苯酚浓度稀释至100mg/L。
Na2B4O7饱和溶液：称取Na2B4O740g，溶于1L蒸馏水中，冷却后使用，此溶液的pH值为10.1。
3% 4-氨基安替比林溶液：称取分析纯4-氨基安替比林3g，溶于蒸馏水中，并稀释至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。
2% （NH4）2S2O8溶液：称取分析出（NH4）2S2O8 2g，溶于蒸馏水中，并稀释至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。
苯酚降解菌筛选及降解特性研究
（ Ｓ ｃ ｈ ｏ ｏ ｌ ｏ ｆＥ ｎ ｖ ｉ ｒ ｏ ｎ ｍ ｅ ｎ ｔ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ， Ｌ ｉ ａ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｓ ｈ ｅ ｎ ｙ ａ ｎ ｇ １ １ ０ ０ ３ ６降解特性研 究
李鲜珠 ， 沈玉冰 ， 马溪平 ， 王 闻烨 ， 李万龙 ， 张宏亮 ， 徐成斌
（ 辽 宁大学环境学院 ， 辽宁 沈阳 １ １ ０ ０ ３ ６ ）
摘要 ： 针 对 焦化废 水 生物难 降 解有机 物含 量 高、 实 际生产过 程 中的 水质 和 水 量 变化 大的 特 点 ， 开展 了高效 菌株 处理含 酚 废水 的试 验研 究 。从 某焦化 厂水 处理 车 间生物 处理装 置 曝 气池活性 污泥 中驯
化、 分 离和 筛选得 到 ４株 以苯 酚为唯 一碳 源的 高效降解 茵 ， 并对 其进行 鉴 定及 降解特 性研 究。结 果
表 明： 初 步鉴 定 ｈ ３ ２ ａ ２ 、 ｂ ３ １ Ｂ 、 ｈ ３ １ Ａ和 ｂ ４ １ ａ为假 单胞 菌属 （ Ｐ ｓ ｅ ｕ ｄ ｏ ｍ ｏ ｎ ａ ￥ ｓ ｐ ． ） ； 通过 溴化 容 量 法测 定 苯酚含 量 ， 确定 了菌株 的最佳 降解条件为 ： 温度 ３ ２ ｏ Ｃ， ｐ Ｈ值 ７ ． ５ ， 培养 时间 １ ６ ｈ ， 接种 密度 １ ％， 且 单一
ｄ ｏ ｍｅ ｓ ｔ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ，ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｉ ｎ ｇ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｅ ｄ ｓ ｌ ｕ ｄ ｇ ｅ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ ａ ｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｔ ａ ｎ ｋ。ａ ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ ｔ ｒ ｅ ａ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｄ ｅ ｖ ｉ ｃ ｅ ，ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｗａ ｔ ｅ ｒ ｔ ｒ ｅ ａ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｐ ｌ ａ ｎ ｔ ｉ ｎ ａ ｃ ｏ ｋ ｉ ｎ ｇ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ｙ ．Ｔ ｈ ｏ ｓ ｅ ｆ ｏ ｕ ｒ ｈ ｉ ｇ ｈ ｌ ｙ ｅ ｉｃ ｆ ｉ ｅ ｎ ｔ ｄ ｅ ｇ ｒ ａ ｄ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｉ ｒ ａ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｗｅ ｒ ｅ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｉ ｆ ｅ ｄ
苯酚高效降解菌的筛选及其降解特性的研究
苯酚高效降解菌的筛选及其降解特性的研究
苯酚高效降解菌的筛选及其降解特性的研究
从活性污泥中分离到1株苯酚高效降解细菌,初步确定为假单胞菌属(Pseudomonas);该菌株能在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基中生长;可以在20～40 ℃、pH值5.0～9.0范围内较好生长;降解苯酚最适温度为35℃,最适pH值为7.0,最大降解率达到89%.完全降解无机盐培养基中500mg/L、1 000mg/L、1 200mg/L的苯酚分别需要60h、72h、108h.
作者：刘广金张袖丽作者单位：安徽农业大学应用化学系,安徽合肥,230036 刊名：现代农业科技英文刊名：XIANDAI NONGYE KEJI 年，卷(期)：2007 ""(11) 分类号：X7 关键词：苯酚生物降解假单胞菌属。
低温条件下高效苯酚降解菌的筛选及降解特性
低， 致使 生化 池 水温 降 至 １ ℃左 右 ， 生物 降解 速率 ８ 微 （ 活性 ） 明显 下 降 ， 出 水 中 的 苯 酚 含 量 超 标现 象严 使 重， 给冬季污 水 厂的正 常运 行造 成 困难 。 因此 ， 本研 究
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第２ 卷 第 ３ １ 期
２０ ０ ７年 ６月
磅 ＲＥＳＯＵ ＲＣＥＳ ＡＮＤ ｉ ≯ Ｉ ｌ 、 ＭＩ ＮＥＲＡＬ ＧＥＯ ．
Ｊｎ ２ ０ ｕ ．， ０ ７
低温条件下 高效苯酚 降解 菌的筛选 及降解特性①
中图分类号 ： ０ Ｘ７ ３
文献标识 码 ： Ａ
文章编 号 ：０ １ ６ ３ ２ ０ ） ３ ０６ 一Ｏ １０ —５ ６ （ ０ ７ ０ － ３ ６ ５
苯 酚的 毒性和 腐 蚀性 很强 ， 是石 油化 工 、 纸 、 造 炼 焦 和纺 织等 工业 废水 中 的主要 污染物 ， 我 国和 美 国 是
１０ ； ０ 两株 菌在通 气状况 良好 的条件下 ， Ａ ｏ 对苯酚 的降解率及 其生长情况 明显优于缺氧条件 。 通过 对比实
验， Ａ４菌株 对 外 界 环 境 的 适 应 性 明 显 强 于 Ｂ ４ 而后 者 的生 长速 率 明 显 高 于前 者 。 １， 关 键 词 ： 业废 水 处 理 ； 工 苯酚 降 解 ； 高效 低 温 脱酚 菌 ； 筛选 ； 解特 性 降
率分别 为９ ． ３ Ｏ ４ ％和９ ． ２ 。 中性条件下 ， ９ Ｏ 在 对苯酚起始浓度小于３ ０ ／ ０ ｍｇ Ｌ的苯酚 降解 率均保持 在９ ％ ８
苯酚降解菌的分离
实验方法
• 3.最优降解苯酚细菌鉴定 • 革兰染色显微镜下观察 • 用接种针挑取少许幼龄培养物，涂布在干净玻片 上的一滴无菌水中，风干固定。 • 用结晶紫的混合液染色1-2min后，用水洗。 • 碘液作用1min，水洗，吸干。 • 用95%的乙醇溶液脱色，流滴至洗脱液至无色(约 30s)。 • 用复红液复染约2-3min，水洗，风干，用油镜观 察。
注意事项
• 1实验人员必须较为清晰的明白实验方法后 才可进行实验 • 2取污泥最好在水流缓的地方，污泥位置稍 微深一点的，细菌才多，机会才打 • 3用到苯酚时，使用手套、口罩防止中毒。
预期结果
经过几天培养后培养液变浑浊 在涂布分离中能观察到单细胞菌落 革兰染色可能为红色也可能为蓝色
本实验的困难
• 实验技术不成熟，甚至不会，可能实验结 果没有是由于实验技术的原因，所以组员 要自己课下学习。 • 实验的未知性：目前分离的苯酚降解菌都 是在苯酚污染的环境中的分离出来的，学 校湖中的污泥不确定是否会分离出目的菌。 • 苯酚的毒性
Thanks
实验材料
• 3、苯酚培养液：苯酚25-75mg，尿素0.1g， 微量元素10ml，蒸馏水90ml，PH7.0-7.2， 121℃灭菌20min。 • 4、革兰染色所需试剂 结晶紫、碘液、95%乙醇、复红、香柏油 PH计，温度计，黑布，接种环，酒精灯， 显微镜
实验方法
• 一、细菌的富集和分离 • 1、从校园小河污泥中取污泥，称取5.00g加到50ml含有 25mg/L苯酚的PMM培养基中。 • 2、于30℃,.220r/min摇床5d培养后，分别添加3次苯酚无 机培养液。 • 隔3天后第一次添加PMM培养液，使苯酚终浓度分别增加 至100mg/l；隔3天后第二次添加PMM培养液，使苯酚终 浓度分别增加至200mg/l；第三次隔3天后，添加PMM培 养液，使苯酚终浓度分别增加至300mg/l 。 • 3、最后取培养液进行系列稀释后涂布于苯酚浓度为 300mg/L的PMM固体培养基平板上，30℃培养3d后挑取 形态上有差异的单菌落,。 • 以上所有培养均用黑布遮盖。
实验一 苯酚降解菌的分离及降解性测定
实验一苯酚降解菌的分离及降解性测定实验原理：在污染环境中，大部分微生物由于受到毒害而死亡，少数微生物具有较强的降解能力或通过诱变改变其基因型或诱导产生某些酶而能在污染的环境中存活，成为有机污染物的高效降解菌或耐性菌株。
从污染环境中取样，通过在选择性培养基上培养，可筛选出目的性微生物。
本实验取青年湖水样作为菌种的来源，在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基进行培养，分离苯酚降解菌。
实验步骤：1. 从污染地区取样品（污水，污泥或受污染的土壤）。
2. 配制无碳源的无机盐培养基，加入苯酚储备液，使培养基中苯酚浓度达100 mg/L。
121℃灭菌20 min。
3. 吸取1 ml活性污泥，加入灭菌培养基，同时做空白对照，28℃恒温摇床培养24 h（160rmp/min）.4. 测定苯酚降解率。
苯酚降解率的测定方法：a.标准曲线的绘制分别吸取0、1、2、3、4、5mL 酚标准溶液（100 mg/L）于50mL容量瓶中，加蒸馏水稀释成20 mL。
加入2 mL pH9.8缓冲溶液，4 mL4％4－氨基安替比林溶液，摇匀后加入4 mL 8％铁氰化钾溶液，显色10min后，加蒸馏水稀释至刻度。
用722型分光光度计460nm波长处比色测定。
b.以不加酚的试剂作空白对照，以浓度为横坐标，以光密度为纵坐标绘制标准曲线。
c.培养液中苯酚降解率的测定吸取培养液2mL于50mL容量瓶中，加蒸馏水稀释成20 mL。
加入2 mL pH9.8缓冲溶液，4 mL 4％4－氨基安替比林溶液，摇匀后加入4 mL 8％铁氰化钾溶液，显色10min后，加蒸馏水稀释至刻度。
用722型分光光度计460 nm波长处比色测定。
d.根据标准曲线求出苯酚含量以分解苯酚的百分数表示酚分解作用强弱。
附：无机盐含酚培养基KH2PO40.5gK2HPO40.5gMgSO4•7H2O 0.2gCaCl2 0.1gNaCl 0.2gNH4NO3 1.0gFeCl210%溶液1滴苯酚100mg/L水1000mL调pH 值7.5，121℃灭菌20min。
高效苯酚降解菌 PDB1的筛选及降解特性研究
高效苯酚降解菌 PDB1的筛选及降解特性研究王图锦;潘瑾;刘雪莲【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2017(017)002【摘要】A bacterial strain which could degrade phenol with high efficiency was isolated from the polluted soils in a coke plant.The strain was named PDB1 and was identified as the genus Acinetobacter sp with 16S rRNA gene sequence .Biodegradation was investigated in details with phenol as the sole carbon and energy source .The results indicated that PDB1 could utilize phenol as a sole source of carbon and could degrade less than 1 200 mg/L phenol completely in 60 h, but higher phenol concentrations had an inhibitory effect .The process of phenol degradation was investigated using Haldane kinetic model .Phenol degradation kinetic studies indicated that the degradation fol-lowed Haldane ’ s model .The optimal concentration of initial phenol was 144.56 mg/L.The rate of phenol degra-dation increased with increasing initial phenol concentrations up to 144.56 mg/L.Further increase in initial phenol concentrations caused decrease in the rate of phenol degradation because of substrate inhibition .The optimal condi-tions for biodegradation of phenol were at 25~40 ℃,pH 7.0~8.0 and 0~5%NaCl.%从一个焦化厂受污染土壤中分离获得一株具有高效降解苯酚能力的不动杆菌属细菌PDB1，以苯酚为唯一碳源和能源对该菌株降酚特性进行研究。
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基金项 目：佳木斯大学学 生创新课题 （课题编号 ：Ｄｚ２０１１—０２１） ＊为通讯作者
· ２５· ２０１１年 ８月
农 业 与 技 术
Ｖｏ１．３１ Ｎｏ．４
荫 种 的甯 集 与驯 化 采用 一 次性 加入 大 剂昂 化 号 】、２、３、４、５、６、７。
合 物 的方法 ［８］。将菌 种在 无菌条 件 下接 种到 ２０ｍＬ
３．１ 结 果
大面积 农 作 物种 植 区 ，利 用 松 花 江 水 进 行 灌 溉 ，
３．１．１ 筛选 出 ７株降解能力强的菌株对苯酚都有 而含酚废水直接排入江中则将对农作物造成毒害 一 定 的点适应 性 ，且对苯 酚有很强的降解能力 ， 作用 ，同时人们适用后有毒物质 在人体 内富集 ，
达 ２５％，血酚浓度为 ０．７４ｍｍｏｌ／Ｌ，１０分钟死亡。 将浓度 为 ｌ０～，１０～，１０～，１０一，ｌ０一 的土样
酚类会对人类的身心健康造成危害，毒害其他生 溶液接种到富集培养基上 ，培养 ４８ｈ后观察。
物 ，破坏了生态系统 的稳定性 ，故我国及其他国
（２）选 择 培 养基［ ］：ＫＮｏ３４．０ｇ，ＮａＣ１ ５．０ｇ，
ｓｏｒｂｅｎｔｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ８Ｏｌ￣ Ｖｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｔｏｗａｎｔｓ ｐｈｅｎｏｌ ａｎｄｉｔｓ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ［Ｊ］．ＲＰ￣ｌｃｔｉｖｅ ａｎｄ ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＰｏｌｙｍｅｒｓ，２００１，４６ （３）：
２５９—２７１
高 浓度 含 酚污 水 的研 究 仍 有 深 度 可挖 ，因此 必 须 ［８］任源 ，吴超 飞，等 ．苯胺分离菌 的驯化筛选研究 ［Ｊ］．环 境
及不 同苯酚浓度下的生长和苯酚降解情况的考察 ，
确定 了这 ７株菌的最适 ｐＨ值为 ７．２，最适生长温
参 考文 献
度为 ２５￣Ｃ，最大可降解苯酚浓度为 Ｏ．７Ｏｇ／Ｌ。
［１］黄蓓佳 ，张兰英 ，等 ．低温条件下 １，２，４一三 氯苯降 解菌 的筛 选
３．１．３ 在低温下生物降解苯酚的代谢基质 中若加 一 些有机碳源或无机盐 可以促进降解作用 ，如葡 萄糖 、硫酸铵 ，硫酸铵对低温条件 下苯 酚的微生 物降解具有促进作用 ，可以考虑在菌群 驯化和低 温苯酚类降解过程 中添加一些。
板划线法 ，挑取单菌落进行细菌的分离 ，反复纯
将筛选出的 ７株抗性菌分离 出来 ，用筛选 培
化 ５次后 ，将培养 的纯种菌种接种至斜 面培养基 养基分别培养。将他们分别接种到不 同 ｐＨ值 的
上继 续 培养 。
固体培 养基 上 ，ｐＨ值 的梯 度分 别 为 ６．２、６．４、
（２）菌种筛选 ：划线法挑取少量 的单一菌落 ６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６，以此获得降解 菌
佳木斯 黑龙 化工 厂排 污 口。 １．１．２ 培 养基
（１）富集培养基 ：蛋 白胨 ５．０ｇ，牛肉膏 １．５ｇ，
人 的苯 酚 口服致死 量 报道不 一 ，ＬＤ为 ２—１５ｇ ＮａＣ１ １．５ｇ，污水 １０００ｍＬ，琼 脂 ｌ５．Ｏｇ，ｐＨ ７．０—
或 ＭＬＤ为 ｌｄＯｍｇ／ｋｇ。国外报道酚液污染皮肤面积 ７．２，培养基 在 １×ｌＯＳＰａ灭 菌 １５ｒａｉｎ后 备用 。然 后
琼 脂 １５．０ｇ，污 水 １０００ｍＬ，ｐＨ ７．０—７．２，１× １０￣Ｐａ灭菌 １５ｍｉｎ。待冷却后加入 １５．０ｍＬ经过灭菌 处理的不同浓度 的苯酚溶液制成固体培养基 ，然 后用平板涂布法接种 ，等 ３天后观察菌的长势情 况 ，观察和记录。 １．２ 实验 方法
１．２．１ 高效苯酚降解菌的富集与驯化
解 菌 ，与此 同时 将 得 到 的苯 酚 降解 菌 配 成无 机 盐
趔
菌 株编号
图 １ 苯酚浓 度对 菌株降解 性 的影响
农 业 与 技 术
２０１１年 ８月 ·２６·
效率的降解苯酚的能力净化废水、保护环境 ，对
３ 结果与分析
维持 可持续 发展 有极其 深远 的意义 。
黑龙化工厂地处松花江上游 ，其沿岸区域有
在排水之前将其 浓度 降低稀释 ，利用生物法处理 含酚废水。此方法危害 ，经济 ，效率高。因此抗 性菌的特性即利用价值受到重视 ，利用抗性菌高
科学研究 ，１９９８，４ （１１）：４—２６ ［９］马放 ，任南琪 ，等 ．污染控制微 生物学 实验 ［Ｍ］．哈尔 滨 ：
哈尔滨工业大学 出版社 ，２００２：６７—８２
作者简介 ：谷凤丽 ，女，佳木斯大学生命科学学院。 张跃华 （１９６２一），男 ，博士，硕士生导师。
３１卷 ４＿ｌｃ｝ ２０１１年 ８，ｊ
农 业 与 技 术
Ａ ａｌｌｎＪ 。ｌｌｎ０ｌ‘
Ｖ０１．３１ Ｎｏ．４ Ａｕｇ．２０１１
‘２４‘
高效 苯 酚 降解 菌 的分 离 与 降解 特 性
谷凤丽
李长 明 马海燕 杨 国坤 韩旭东 崔亚旭 秋 梦影
（佳木斯大学生命科学学院 ，黑龙江 佳木斯 １５４００７）
７．６ １．２５６
２．２ 苯酚初 始 浓度 的影响
菌悬液，按 １２ｍＬ的接种量接到 ｐＨ７．２，苯酚初始
将 用 选 择培 养 基 扩大 培养 的生 长状 况 良好 的 浓 度 分 别 为 Ｏ．０５、 ０．１０、 ０．１５、 ０．２０、 ０．２５、
待 测 的各种 菌 体分 离 出来 ，用 筛选 培 养 基 培养 分 ０ ３０、 ０．３５、 ０ ４０、 ０．４５ ０．５０、 ０ ５５、 ０ ６０
离得到的各种菌，无菌条件下用划线法将纯菌落 ０．６５、０．７０、０．７５ｇ／Ｌ的 培 养 基 中 ，于 １１０ｒ／ｍｉｎ、
接种到固体培养基上。将得到的菌体用更 高浓度 ２５℃摇 床 振荡 培 养 ，４８ｈ后 测 培 养 基 的 吸光 度 及
的苯酚培养基驯化 以待变异成更具 降解能力 的降 计算残余的苯酚浓度。
农业技术学院学报 ，２００Ｏ，１３（１）：４ｏ一４４ ［６］Ｆｅｗｓｏ ｎ ＣＡ．Ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｔｈｅ ｇｒａｎｍｅｇａｔ ｉｖｅ ｈａｃｔｅｒｉｕｍＮＣＩＢ８２５０
［Ｊ］．Ｊ Ｇｅｎ Ｍ ｉｃｒｏｂｉａ ｌ，１９６７，（鸫）：１０７—１１０ ［７］Ａｎ Ｗ，Ｔｒｏｃ￣ ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｔｒｅａｔ．Ｈｉｇ｝ｄｙ ｐｏｌｍｌｘｆｌｙｍｅｒｉｅ·
ｅｎｃ＠，１９６８， （１６１）：１０９３—１０９７
［４］Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｌ，Ｌｉｏｎｇ￣ ＭＰ，Ｃｅｌａ Ｒ．Ｓｄｉｄｐｈ￣ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｉ＂ｐｈｅｎｏｌｓ
３．２ 分 析
［Ｊ］．Ｊｃｓａｎａ ｌ ￣ ｏｇｒ ｓｐｈｙＡ，２０００，８８５（１／２）：２９１—３０４
由于工农 业 迅猛 发 展 ，同时 对含 酚废 水 的 配 ［５］简放棱 ，黄凯那 ．合成酚醛树脂废水前 处理初探 ［Ｊ］．仲 剀
分离出单一的降解菌继续培养待鉴定 ，并将其编 的最适 ｐＨ值 ，培养 ４８小时后观察并记录。
表 １ ｐＨ值对菌 株 的影响 （分解能 力最强 的 ４号菌 株为例 ）
ｐＨ值 ６．２
６．４
６．６ ６．８ Fra bibliotek７．Ｏ
７．２
７．４
吸光 度值 Ｏ．９７６ ０．８５０ ０．７４３ ０．５９８ ０．５１２ ０．３８６ ０．９４３
方监管漏洞，如今含酚废水 的不合理排放污染 了 水资源 ，严重影响了人们 的身心健康 ，并 已成为 城市可持 续发展道路 上的障碍。水是生命之源 ， 由于水循环过程又污染 了整个生态 系统 ，进而威 胁到人类的生存质量 ，由此改善水污染 环境 已迫 在 眉 睫 。 目前 虽 然 含 酚 污水 的研 究很 广 泛 ，但 对
张跃华
【摘 要】从佳木斯黑龙化工厂活性污泥中筛选到７株高效苯酚降解茵。其可以利用苯酚作为唯一的碳源和能源物质。通过这７
株 茵在不 同的温度 、ｐＨ值及浓度下生长和苯酚降解情况的研 究，确定 了此 ７株茵的最适 生长温度 ２５℃ ，最适 ｐＨ值 ７．２，并测得 降 解最 大的酚浓度 ７００￣：／Ｌ。该 ７株 苯酚 降解茵 的降解能 力研 究表 明 ：其具 有较 强的苯 酚降解 能力 ，在 ２５℃ ，ｐＨ值 ７．２、装液 量 １０８￣Ｌ、接种量 １２ｍＬ、摇床振 荡速度 １１０ｒ／ｍｉｎ及 固体培养条件 下培养 ４８ｈ，观察抗性 茵生长的状态，茵落数量及测定吸光度值从 而
其 Ｏ．５ Ｌ和 Ｏ．６５ Ｌ浓度 的苯酚降解率达到 ９０％ 进而对人体有直接或潜在的威胁。借 以东北地 区
以上 ，最大苯酚降解浓度达到 ０．７Ｏｇ／Ｌ。
特有的寒冷气候 ，苯酚降解菌的研究也对将来大
３．１．２ 通 过对这 ７株菌在不 同温 度、ｐＨ值、以 面积的低温微生物的研究提供了参考资料。
及 降解特性 ［Ｊ］．环境科学研究 ，２ＯＯ８，２１（５）：１９—２２
［２］金相灿 ，程 振华 ，等 ．有机化合物 污染化学 ［Ｍ］．北京 ：清
华大学出版社 ，１９９９：２５０—２６５
［３］Ｇｉｂｓｏｎ ＤＴ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｅｇｒａｄａｔ ｉｏｎ ０ｆｇｒｏｉｌ￣ ｃ ｃ０ｌ
［Ｊ］．Ｓｃｉ—
判定 对苯酚 的降解情况 。
【关键词】高效；苯酚降解茵；降解特性
中图分 类号 ：Ｏ６２５．３１
文献标 识码 ：Ａ
苯 酚 （Ｃ６Ｈ６ＯＨ，ＰｈＯＨ），又 名 石 炭 酸 、羟 基
苯 ，是结构最简单 的酚类有机物，弱有机酸 ，常 １ 材料与方法
温下为无色 晶体 ，微溶于水 ，易溶 于有机剂 ，当
温度高于 ６５℃时 ，能跟水 以任意比例互溶 。有毒 １．１ 材 料
性和腐蚀性 ，低浓度酚溶液使蛋 白变性 ，高浓度 １．１．１ 样 品来 源
则 使 蛋 白质沉 淀 。对 皮 肤 和 粘膜 有 强 烈 的腐 蚀 作 用 ，也可抑制 中枢神经系统 和损 害肝、肾功 能。 其溶液沾到皮肤上应立即用酒精擦洗。