细胞生物学实验

细胞生物学实验讲义
河池学院化生系生物教研室
2011年3月
目录
1.细胞生物学实验简介
2.实验一细胞膜的通透性观察
3.实验二植物细胞骨架的观察
4.实验三线粒体的超活染色与观察
5.实验四细胞融合
6.实验五叶绿体的分离与观察
7.实验六酸性磷酸酶的显示方法8．实验七联会复合体的染色与观察9．实验八死、活细胞鉴别
10.附录：生物绘图法
细胞生物学实验简介
细胞生物学是当前生命科学中核心学科之一，也是重要的专业基础课，其理论与实验技术已广泛地用于研究细胞的形态结构、基因表达与克隆、病毒、细菌、胚胎发育、远缘杂交、人类疾病的发病机制、药物机理等领域，随着分子生物学的研究渗入，分子细胞生物学也得到了突飞猛进的发展。

目前许多综合大学、农业、医学及药科大学把细胞生物学作为本科生和研究生的必修课或基础理论课，同时也开设了专门的细胞生物学实验课，学生们通过实验，进一步地加深了对理论课的理解，也为今后的专业实验课和毕业论文实验奠定了基础。

本讲义精心选择了细胞生物学中的常规实验，作为教材面向本系生物专业本科生进行讲授。

实验一细胞膜的通透性观察
一、实验目的
1.了解细胞膜对物质通透性的一般规律。

2.了解溶血现象及其发生机制。

二、实验原理
细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。

它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。

各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。

渗透作用是细胞膜的主要功能之一。

将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。

将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。

因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。

本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。

三、实验用品
(一) 材料鸡血细胞
（二）器材普通显微镜、普通离心机、扭力天平、10ml 试管、10ml 刻度离心管、试管架，2ml 注射器（无需针头）或5ml 移液管、洗耳球、滴管、载玻片、擦镜纸、记号笔等。

（三）试剂
1．Alsever 溶液
葡萄糖 2.05g
柠檬酸钠(Na9C6H5O7.2H2O) 0.89g
柠檬酸（C6H 6O7.H2O） 0.05g
氯化钠 0.42g
蒸馏水 100ml
调PH 至7.2，过滤灭菌或高压灭菌10min，置4℃冰箱保存。

或者葡萄糖(Glucose) 2.05g，柠檬酸钠 0.8g，氯化钠0.42g，溶于100ml重蒸水。

2. 0.128 mol/L NaCl 溶液。

3． 0.05 mol/L NaCl 溶液。

4． 0.4 mol/L NaCl 溶液。

3. 0.128 mol/L NH4Cl 溶液。

4. 0.128 mol/L NH4AC 溶液。

5. 0.128 mol/L NaNO3溶液。

7. 0.32 mol/L 葡萄糖。

8. 0.32 mol/L 甘油。

9. 0.32 mol/L 乙醇。

10. 0.32 mol/L 丙酮。

11. 蒸馏水。

四、实验操作
1．从集市买一只活鸡现杀取血5ml（防止污染），放入盛有20ml Alsever’s 液瓶中，混匀后置冰箱保存备用（2 周内使用）。

2. 使用前，取用Alsever’s 液保存的新鲜鸡血5ml ，加入8ml 的0.128 mol/L 的
NaCl 溶液，小心混匀，1000 r/min 离心5min，如此3 次洗涤，最后配成30%的鸡红细胞（CRBC）悬液。

3. 取11 支试管，按附表中所示测试溶液，分别取样各3ml，作出标记后，各管均加
入红细胞悬液2 滴，混匀后静置于温室中，观察各支试管中发生溶血的时间及其变化。

五、观察结果
1. 试管内液体分两层：上层浅黄色透明，下层红色不透明为不溶血（－），镜检红
细胞完好呈双凹盘状。

2. 如果试管内液体混浊，上层带红色者，称不完全溶血（＋或＋＋），镜检有部分
红细胞呈碎片。

3. 如果试管内液体变红而透明者，称完全溶血（＋＋＋），镜检发现细胞全部呈碎
片。

六、实验建议
1. 鸡血在离心时，试管均需在扭力天平上平衡。

2. 目测红细胞体积或置于带刻度的离心管中，加入生理盐水配成30%的红细胞悬液；
3. 试管中有红细胞和测试溶液时，不应强力摇晃，以免造成人为的红细胞破裂。

七、实验报告及作业：
表4-1 各种溶液的溶血现象观察结果
编号测试溶液是否溶血时间分析原因
1 0.128 mol/L NaCl
2 0.05 mol/L NaCl
3 0.
4 mol/L NaCl
4 0.128 mol/L NaNO3
5 0.128 mol/L NH4Cl
6 0.128 mol/L NH4AC
7 0.32 mol/L 甘油
8 0.32 mol/L 乙醇
9 0.32 mol/L 丙酮
10 0.32 mol/L 葡萄糖
11 H2O
书写实验报告，并就细胞膜对不同物质的渗透性不同，对实验结果进行分析见表4-1。

目测法判断标准：快速溶血：＋＋＋；慢速溶血：＋＋或＋；不溶血：－
实验二细胞骨架的观察
1 实验目的
（1）掌握用光学显微镜观察植物细胞骨架的原理及方法；
（2）观察光学显微镜下细胞骨架的网状结构。

2 实验原理
细胞骨架(cytoskeleton)，是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同可分为微丝、微管和中等纤维。

细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。

本试验采用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝
R250染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。

染色时用的M-缓冲液，其中咪唑是缓冲剂，EGTA和EDTA螯合Ca2+离子，溶液中并提供Mg2+离子，在此低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张。

3 实验用品
（1）材料：洋葱鳞叶
（2）试剂
①0.2mol/L Na2HPO4/KH2PO4缓冲液(pH7.3):
0.2mo1/L Na2HPO4 77 ml
0.2mo1/L NaH2PO4 23 ml
②0.01 mol/L 磷酸盐缓冲生物盐水(PBS)配法：0.2mol/L Na2HPO4/KH2PO4缓冲
液(pH7.3) 50 ml，NaCl 0.15 mol/L，重蒸馏水至1000 ml。

③M-缓冲液：50mmol／L咪唑、50mmol/L氯化钾、0.5mmol／L氯化镁、1mmol/L 乙二
醇(a-氨基乙基)醚四乙酸（EGTA）、0.1mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）； 1mmol ／L巯基乙醇，4 mmol/L甘油，用1 mol/L HCl调pH至7.2。

④ 1%的Triton X-l00/M-缓冲液：Triton X-l00 1ml，M-缓冲液99ml。

⑤0.2%考马斯亮蓝R250染液：称考马斯亮蓝R250 1g，溶于250ml无水乙醇中，加冰
醋酸35ml.再加蒸馏至500ml。

⑥3%戊二醛-PBS溶液，pH7.3。

（3）器材普通光学显微镜、恒温箱、培养皿、烧杯、吸管、载玻片及盖玻片、镊子。

4 实验方法
（1）用镊子撕取洋葱鳞叶内侧的表皮若干片（约1cm2大小），置于50mL烧杯中，加入PBS缓冲液漂洗2分钟；
（2）吸去PBS缓冲液，加入1％ Triton X—100 处理20min。

（Triton X-l00是非离子型表面活性剂(去污剂)，能增加细胞膜通透性并抽提部分杂蛋白质，使骨架
图像更清晰）
（3）吸去Triton X—100，用M缓冲液漂洗3 次,每次5min。

（稳定细胞骨架）（4）用3％戊二醛固定20min。

（5）PBS 缓冲液漂洗3次，每次5min。

（6）0.2%考马斯亮蓝R250染色10min。

（7）蒸馏水洗2次，然后将样品置于载玻片上, 加盖玻片于普通光学显微镜下观察。

实验建议：
（1）. 用去垢剂TritonX-100 的缓冲液处理材料时，应控制在30min 左右。

（2）. 每一次加液或染色后，应用PBS 洗2 次，并用滤纸吸干。

5 实验结果
描绘所观察到的植物细胞骨架图。

（参考图）
6 思考及作业题
（1）显示细胞骨架的原理是什么？
（2）说明实验中使用的TritonX-100、M-缓冲液、戊二醛、考马斯亮蓝R-250的作用。

洋葱内表皮细胞骨架
实验三线粒体的超活染色与观察
一、实验目的
1. 观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。

2. 学习一些细胞器的超活染色技术。

二、实验原理
活体染色是指对生活有机体的细胞或组织某些结构能着色但又不影响细胞的生命活动和产生任何物理化学变化以致引起细胞的死亡的一种染色方法。

因此活染技术通常可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。

根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。

体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。

体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。

詹纳斯绿B 是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。

三、实验用品
（一）材料肝细胞、人口腔上皮细胞、洋葱鳞茎内表皮细胞
（二）器材显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。

（三）试剂
1．Ringer 溶液
氯化钠 0.85g
氯化钾 0.25g
氯化钙 0.03g
蒸馏水 100ml
2. 1%詹纳斯绿B 溶液（原液）
称取50mg 詹纳斯绿B 溶于5ml Ringer，稍加微热(30～40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。

3. 詹纳斯绿B 溶液（应用液）
取1%原液1ml 加入49ml Ringer 溶液, 混匀即可。

现用现配。

四、实验操作
1. 人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察
(1) 取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴2 滴詹纳斯绿B 应用染液。

(2) 实验者用牙签宽头在自己口腔粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物
放入载玻片的染液滴中，染色10～15min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)，盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。

(3) 在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。

可见扁平
状上皮细胞的核周围胞质中，分布着一些被染或蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是线粒体。

2. 小白鼠肝细胞线粒体的超活染色观察
(1) 用脊椎脱臼法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝边缘较薄的
肝组织块，放入表面皿内。

用吸管吸取Ringer 液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。

(2) 在干净的凹面载玻片的凹穴中, 滴加詹纳绿B 应用液，再将肝组织块移入染液，
注意不可将组织块完全淹没，要使组织块上面部分半露在染液外，这样细胞内的线粒体表面可充分得到氧化，易被染色。

当组织块边缘被染成蓝绿色即成(—般需染20～30min)。

(3) 吸去染液，滴加Ringer 溶液，用眼科剪将组织块着色部分剪碎，使细胞或细胞
群散出。

然后，用吸管吸取分离出的细胞悬液，滴一滴子载玻片上，盖上盖玻片进行观察。

(4) 在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜或油镜下观察，可见具有l～2 个核
的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分布状况。

3. 洋葱鳞茎表皮细胞线粒中的超活染色观察
(1) 用吸管吸取詹纳斯绿B 应用染液，滴一滴于干净的载破片上，然后撕取一小片
洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色10～15min。

(2) 用吸管吸去染液，加—滴Ringer 液，注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行
观察。

(3) 在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据、细胞核被挤至—侧细
胞壁处。

细观察细胞质中线粒体的形态与分布。

五、实验报告及作业
绘制口腔上皮细胞、洋葱鳞茎表皮细胞、小白鼠肝细胞中线粒体的形态与分布。

实验四细胞融合
1 实验目的
（1）通过PEG介导的鸡血细胞融合实验, 对体细胞融合有一个清楚的概念；
（2）初步掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术；
（3）观察血细胞的凝集现象。

2 实验原理
本实验利用PEG介导的动物细胞融合，PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝聚；②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个大的双核或多核融合细胞。

利用PEG介导细胞融合, 其融合效果受以下几种因素的影响。

1. PEG的分子量与浓度: 细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高, 对细胞的毒性也就越大。

为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。

2. PEG的pH值: 经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。

3. PEG的处理时间: 处理时间越长，融合效果越好, 但对细胞的毒害也就越大。

故一般将处理时间限制在1分钟之内。

本实验中细胞融合后无需继续培养, 故处理时间可适当放宽至数分钟。

4. 融合时的温度: 由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。

因此，为了获得更好的融合效果, 在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。

对于哺乳动物的细, 一般采用的温度为38~40℃。

本实验所用材料为鸡的血细胞，这是因为: 1. 鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别；2. 实验材料便宜、易得。

细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。

细胞内只有一个核，定为未融合细胞；有二至多个核，定为融合细胞。

3 实验用品
（1）器材：普通离心机、普通光学显微镜、100ml量筒2个, 滴管10支, 10ml刻度离心管20支, 载、盖片各20片。

（2）试剂：①Alsever溶液。

②GKN溶液：氯化钠 8g，氯化钾0.4g，Na2HPO4•2H2O
1.77g，NaH2PO4•H2O 0.69g，葡萄糖 2g，酚红0.01g，溶于1000ml重蒸水中。

③0.85%生理盐水。

④50% PEG液 (现用现配)
根据实验需要，称取适量PEG(Mr.4000)放入刻度离心管内，在酒精灯上将其加热熔化，待冷却至50℃，加入等体积的已预热至50℃的GKN液并充分混匀，置37℃备用。

（3）实验材料：新鲜鸡血。

4 实验方法
将Alsever液与活鸡翼下鸡血混成1:4悬液（抗凝效果最佳）
↓
4度冰箱保存
↓
取上述悬液1ml加入生理盐水4ml混匀
↓
1200r/min离心5分钟
↓弃上清
上述离心速率重复离心两次(5min, 10min)
（以达到去除细胞表面粘附物质的目的）
↓弃上清
加入适量GKN液，配成10%细胞悬液
↓
取悬液以血球计数法计数，
↓
再用GKN液将红细胞的浓度稀释至1×106 个/ml
↓
取以上细胞悬液1ml于离心管，37℃预热，50%的PEG液一并预热20min
↓
20min后将0.5ml 50% PEG逐滴沿离心管壁加入到1ml细胞悬液中，边加边摇匀，然后放入37℃水浴中保温20min
↓
加入GKN溶液至8ml，静置于水浴中20min左右
↓
1200r/min离心5分钟，加GKN溶液再离心一次
↓
弃去上清，加入少量GKN液少许，混匀，取少量悬浮于载玻片上，加入Janus green 染液，用牙签混匀，3min盖上盖玻片，观察细胞融合情况
5 实验结果
描述细胞融合现象。

6 思考及作业题
（1）本实验的原理？
（2）本实验有哪些注意事项？
PEG诱导的鸡红细胞体外融合实验
实验五叶绿体的分离与观察
一、实验目的
1. 通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。

2. 观察叶绿体以及气孔、表皮细胞、保卫细胞的形态，加深对植物组织形态的了解。

二、实验原理
将植物组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。

一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状、稠密度，也与离心力以及悬浮介质的粘度有关。

在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。

依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。

叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L 氯化钠或0.4mol/L 蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。

将匀浆液在1000 r/min 的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些末被破碎的完整细胞。

然后在3000 r/min的条件下离心
5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。

分离过程最好在0～4℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。

三、实验用品
(一) 材料新鲜菠菜或其它植物叶片
（二）器材普通离心机、组织捣碎机、扭力天平、光学显微镜、500m1 烧杯2 个、250m1 量筒1 个、滴管10 支、10m1 刻度离心管20 支、纱布若干、载玻片和盖片等。

（三）试剂 0.35mol/L NaCl 溶液。

四、实验操作
1. 游离叶绿体的制备与观察
（1）选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g 于150ml的
0.35mol/L NaCl 溶液中，装入组织捣碎机。

（2）利用组织捣碎机低速(5000 r/min)匀浆3～5min。

（3）将匀浆液用200 目尼龙网或6 层纱布过滤，收集于500m1 烧杯中。

（4）取滤液4m1 在1000 r/min 下离心2min。

弃去沉淀。

（5）将上清液在3000 r/min 下离心5min。

弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞核)。

（6）将沉淀用0.35mol/L NaCl 溶液悬浮。

（7）取叶绿体悬液1 滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜下观察。

2. 组织中叶绿体的观察
取新鲜植物嫩叶适量，放入研钵中，加入少量的0.35mol/L NaCl 溶液碾碎，用
滴管吸取上层浸出液，镜下观察叶肉细胞结构中的叶绿体和保卫细胞等形态。

五、观察结果
1. 在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有
较深的绿色小颗粒，即基粒。

2. 表皮细胞呈鳞片状或不规则形，常与气孔连在一起，呈无色。

3. 叶肉细胞呈长方形或类方形，内含有大量带有绿色的叶绿体颗粒细胞，后者有时
呈单一或多个排列。

另外，视野下还可见到大量散在的点状或类圆状叶绿体颗粒。

4. 叶脉导管呈螺纹状。

5. 保卫细胞呈肾状，两个组成一个气孔。

6. 气孔有时呈纺锤形、圆形（开放时），有时呈条形（闭合时）。

六、实验建议
1. 植物组织匀浆后要悬浮在等渗介质中进行差速离心；同时叶绿体的分离最好在
0～4℃的条件下进行。

2. 如用荧光显微镜观察叶绿体，则可以取一滴叶绿体悬液在无荧光载片上，再滴加
一滴0.01% 吖啶橙染液染色1min，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察。

可见叶绿体发出桔红色荧光，细胞核则发出绿色荧光。

七、实验报告及作业
1. 画出分离后的细胞组分（注明形态的放大倍数）。

2. 分离细胞组分时，为什么要加入0.35mol/L 氯化钠？
实验六酸性磷酸酶的显示方法
一、实验目的
1. 掌握Comori 法的基本原理和方法。

2. 观察酸性磷酸酶在细胞内的分布状况。

二、实验原理
酸性磷酸酶能分解磷酸脂而释放出磷酸基，在PH5.0 的环境中，磷酸基能与铅盐反应形成磷酸铅。

但因其是无色的，所以再经过与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀，由此就能显示酸性璃酸酶在细胞内的存在与分布。

本实验的技术特点是：①用冷冻涂片和中性福尔马林固定，可避免在固定、包埋及制片过程中酶的失活，保证了实验的稳定性。

②采用较短的作用时间，可避免细胞质内其它蛋白质及核内出现阳性假象，保证了实验的可靠性。

③以姬姆萨染色的巨噬细胞为观察对象，细胞核及细胞轮廓以及细胞质中反应沉淀的颗粒都比较清晰，有助于深入理解细胞吞噬作用、浴酶体功能和分布以及溶酶体标志酶——酸性磷酸酶的性质。

三、实验用品
（一）材料小鼠腹腔液涂片(重点观察巨噬细胞)
（二）器材高压灭菌锅、冰箱、注射器、载玻片、盖玻片及温箱。

（三）试剂
1. 10%中性福尔马林(pH6.8～7.2)
甲醛 10ml
醋酸钠 2g
蒸馏水 90ml
2. 酸性磷酸酶作用液
蒸馏水 90ml
0.2mol/L 醋酸缓冲液(pH4.6) 12ml
5%硝酸铅 2ml
3.2%β-甘油磷酸钠 4ml
先将蒸馏水和醋酸缓冲液混合，随后分成大致相等的两份，一份中加醋酸铅溶液，另—份加甘油磷酸钠溶液，然后再将两者缓缓混合，边混匀边搅匀。

若PH＜5.0，可加少量醋酸调节。

临用前配制。

配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀，否则将严重影响实验结果。

3. 1%硫胺溶液
硫化胺 1ml
蒸溜水 9ml
4. 姬姆萨染液(1:30)
姬姆萨原液 3 滴
磷酸盐缓冲液(PH6.8) 5ml
5. 3%淀粉肉汤
牛肉膏 0.3g
蛋白胨 1.0g
氯化钠 0.5g
蒸馏水 100ml
高压灭菌9.9×104Pa(15 磅)20min，再加入可溶性淀粉6g，60～80℃水浴溶
解后，4℃冰箱保存备用。

四、实验操作
1. 取小白鼠1 只、每日腹腔注射6%淀粉肉汤1m1，连续注射3 天。

2. 第3 天注射后3～4h，脱颈处死小鼠，打开腹部皮肤，暴露腹膜，再向腹腔内注
射生理盐水2ml，过3min 后在原注射部位抽取腹腔液0.1～0.2ml。

3. 将腹腔液滴在预冷的载玻片上，每片1～2 滴。

将玻片垂直插入玻片架，迅速放
到冰箱内(4℃)，让细胞自行铺展。

4. 30min 后，将玻片转入10%中性福尔马林，4℃冰箱内固定30min。

5. 自来水漂洗5min，把水沥干。

6. 转入酸性磷酸酶作用液中，37℃处理30min。

7. 自来水漂洗片刻。

8. 1%硫化胺处理3～5 min。

9. 自来水冲洗，甩干。

10. 用1:30 的姬姆萨染液染色15min。

11. 自来水冲去染液，用磷酸盐缓冲液临时封片，镜检。

12. 对照实验
将第3 步的腹腔液涂片置50℃温箱中处理30min，使酶失活，再进行6～11
步的同样实验。

五、实验结果
在巨噬细胞的细胞质中，出现许多棕色或棕黑色的颗粒和班块。

部分细胞内，酸性磷酸酶极为丰富，整个细胞质区域都有黑色沉淀。

中性粒细胞呈现阴性反应。

六、实验报告及作业
1. 简述酸性磷酸酶显色的原理是什么？
2. 绘制一张实验所见的巨噬细胞中酸性磷酸酶显色图。

实验七联会复合体的染色与观察
1977年Moses证明光镜可以检查联会复合体，其后发展了许多用于明视野显微镜观察的方法，依靠光镜显示联会复合体，不仅对SC的构造、功能的研究有用，而且在临床细胞遗传学中对研究染色体异常现象也是有用的，它大大加快了SC的研究特别是X、Y染色体配对行为的研究，并导致了X染色体上一种特殊发夹状结构的表现。

一、实验目的：
1、观察光镜下联会复合体的形态。

二、实验原理：
联会复合体是指在减数分裂前期，同源染色体的配对行为所形成的一种特殊结构，由侧线、横线和中央轴三部分组成，在前期的粗线期结构较典型，它是动植物同源染色体联会时相当普遍的一种结构。

三、试剂和器材
实验材料：
小白鼠（雄）
器材：
离心机、显微镜、水浴（65℃）、培养皿（直径16cm）、镊子、剪刀、吸管、烧杯、
量筒、离心管（10ml）、酒精灯、刻度吸管、镜油、擦镜纸、载玻片、台秤。

试剂：
① 0.7％柠檬酸钠溶液。

② 3％中性福尔马林溶液；8.3ml福尔马林溶液。

醋酸钠1.1克。

加蒸馏水
91.7ml。

③ 50％硝酸银溶液
④ 2.0％明胶；称取2克明胶粉末，溶解于99ml蒸馏水中，加1ml甲酸。

⑤甲醇、冰醋酸。

四、实验方法
1、脱颈处死动物，取出睾丸，放入盛有1ml 0.7％柠檬酸钠培养器中。

2、分离并剪碎精小管，用吸管轻轻吹打，使精小管内容物释放出。

3、移至刻度离心管中，加4ml 0.7％柠檬酸钠溶液制成细胞悬浮液，室温下
低渗45—60分钟。

4、在低渗终止前10分钟，加3％中性福尔马林液0.15ml，至最终浓度为
0.1％混匀。

5、常规离心（1000rpm，10分钟），弃去上清液。

6、加入甲醇和水醋酸（3：1）混合液（临时用配制）5ml，固定10分钟。

7、以10000rpm离心5分钟，弃去上清液。

8、重复6—7步一次。

9、加入1ml新鲜固定液，混匀。

10、吸取细胞悬浮液，滴2—3滴于湿冷的载玻片上，置酒精灯上略加烧烤。

11、银染：加4滴50％AgNO3和2滴明胶天载玻片细胞面上，混匀，覆以擦
镜纸，置酒精灯上烧烤，至玻片标本呈褐黑色为止。

12、以流水冲，去擦镜纸，晾干。

13、镜检。

五、实验报告：
1、做好实验记录。

2、绘制联会复合体形态草图。

实验八死、活细胞鉴别
实验目的：
1掌握鉴定死、活细胞的常用方法及原理。

2观察死、活细胞在形态及染色方面的主要差异。

下面介绍两种比较常用的方法
方法（一）染色排除法
实验原理和方法：
组织培养中检查细胞死活最常用的方法是染色排除法，即以死活细胞对色素的不同吸附能力来鉴别，这种方法简单，适用。

但严格地说，它只能判断细胞的代谢死亡，不反应细胞能否增殖。

由于未经固定、染色，所以不能看到死、活细胞的形态差别，样品也不能保留。

本实验介绍动物细胞染色排除法常用的染料及染色方法：
第一类死细胞着色：使死细胞着色的大多是酸性染料，它们不容易穿透活细胞的质膜进入细胞内，却能渗进死亡的细胞，使之着色。

1.台盼兰（Trypan Blue）：将台盼兰溶于被检测细胞所需的生理盐水中，
配成0。

5—1。

0%溶液，调PH7。

0—7。

2，每毫升细胞悬液约加0。

1毫升染液，混合后约2分钟即可镜检。

死细胞被染成兰色。

因台盼兰有轻度的毒性，染色时间不宜太长。

染色时间15分钟以上，活细胞也会因为受损而着色。

台盼兰染液不宜久存，陈旧者有毒性。

2.苯胺黑（Aniline black）：0。

05%苯胺黑Hanks溶液以1：10量与细胞
悬液混合1-2分钟后，镜检，死细胞着黑色。

此染料毒性很小。

3.赤显红B（Erythrosin B）：细胞先用Hanks液或PBS溶液洗，以除尽培
养基中的或细胞周围的血清，取适量细胞与0。

02%的赤显红B混合，两小时之内镜检，死细胞着红色。

第二类：活细胞着色法。