基因组研究技术与平台
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Module und Variations_E 17
重组子鉴定
挑分离良好，大小中等的菌落 培养5ml菌液
小量制备质粒
酶切，琼脂糖凝胶电泳
测序
Module und Variations_E 18
基因表达
选择表达系统
原核系统 真核酵母
动物细胞
植物细胞
构建表达载体
重组克隆载体
目的基因亚克隆
表达载体
正确的ORF
(以上两项过高，易出现星号活性）
双酶切反应：
(1)双酶切缓冲液 (2)先低盐,后高盐
Module und Variations_E 6
琼脂糖凝胶电泳 Agarose Gel Electrophoresis
Module und Variations_E 7
酶切反应与电泳技术
应用举例
(1) 基因酶谱分析
转化宿主: JM109 DH5 TG1 (competent cell ) 重组子的筛选与鉴定
Module und Variations_E 13
Amp Tet
pBR322
重组子的筛选与鉴定
插入片段
Baidu Nhomakorabea
Tet平板
抗药性标志的选择
Amp平板
Module und Variations_E 14
重组子的筛选与鉴定－蓝白筛选
Sept.2,2006
organ
tissue
cell
Molecular Biology
DNA
RNA
In which level we know about the life ?
Protein
what we are trying to do ?
1.To repress the mutant /pathogenic genes and inhibit its production 2.To Correct the mutants and enhance the normal ones
How to know the role of the gene of interest plays in
the life activities furtherly ?
Knock out （基因敲除）
Locus of interest gene in the genome
Module und Variations_E 8
酶切反应与电泳技术
（２）鉴定DNA分子量
(3)胶回收纯化DNA
low- melt agarose
Module und Variations_E 9
酶切反应与电泳技术
生物信息学分析酶切位点
Module und Variations_E 10
酶切反应与电泳技术
导入细胞: 化学方法（CaCl2)、电转化 、显微注射、 基因枪
外源基因表达: 化学诱导、温度诱导
基因表达检测: SDS-PAGE 、RT-PCR、Western Blot
Module und Variations_E 19
转基因动物过程示意图
Module und Variations_E 20
Module und Variations_E 21
(3) 基因治疗与疫苗的核酸 (超纯) 亲和层析，去除热源(内毒素)
DNA纯度: OD260/OD280= 1.7~1.8
Module und Variations_E 5
酶切反应与电泳技术
2. 酶切反应与电泳技术
限制性内切酶酶切反应 （ Restriction Endonucleases） 酶量: 1μ g:1U/1h 通常用量 ：5倍 甘油浓度：不超过5%
Am
lacZ
宿主菌
N2H
N片段
C片段
COOH
（ß-半乳糖苷酶）
原理
Module und Variations_E 15
X-gal
原理 Lac Z
蓝色化合物
重组子
Module und Variations_E 16
（LacZ基因 N端 序列）
LacZ基因 N 端序列
LacZ酶
插入片段
（LacZ基因失活）
Restriction map for the gene of trefoil family factor 2
Module und Variations_E 11
3. 基因重组与表达技术
基因来源:
酶切片段
mRNA
cDNA (RT-PCR)
PCR产物
化学合成：单链寡核苷酸
互补寡核苷酸链退火时, 注意温度变化要非常的缓慢,有利
But How ?
Module und Variations_E 2
Molecular Biology
分子生物学技术
1. 核酸的提取与纯化
5. 核酸杂交与基因芯片技术
2. 酶切反应与电泳技术 3. 基因重组与表达技术
Technique for
Nucleic Acid
6. 反义核酸技术与 RNAi 7. 基因组研究技术与平台
Molecular Biology Technology
Gene mRNA
Translation at ribosome
Protein
Jiankun Huang lab Center of Zhongshan Hospital Affiliated to Xiamen University, China
膜过滤法（对抗冷冻的全血） 磁珠提取法（不用离心、酚／氯仿 、乙醇)
Module und Variations_E 4
核酸的提取与纯化
核酸纯化
(1) PCR扩增产物
电泳
胶回收 (去除非特异性扩增产物、 dNTPS ，引物 Taq酶）
(2) DNA载体及重组子（大于20kb)
易污染宿主染色体断裂成的大分子DNA片段 用切割线状及开环的DNA,对闭合的DNA无作用的 Plasmid safe ATP- dependent DNAase
4. PCR与荧光定量PCR技术
8. 核酸与蛋白质相互作用研究技术
Module und Variations_E 3
核酸的提取与纯化
1. 核酸的提取与纯化
材料选择: 丰度高、容易提取的组织（组织、全血、血清、质粒）
提取过程: 破细胞 去杂质
浓缩
纯化
选择方法
酚抽提法
(注:当酚被氧化成醌，显红色, 会使核酸降解)
于寡核苷链完全正确互补成双链 (95℃
自然冷却至室温)
Module und Variations_E 12
克隆重组
克隆载体的选择
抗生素双抗性载体： pBR322( amp+, tet+) 互补筛选: pUC19 pBluecript II
基因与载体的连接 外源片段与载体的比例： 平端 (3-10):1，粘端 1:1
重组子鉴定
挑分离良好，大小中等的菌落 培养5ml菌液
小量制备质粒
酶切，琼脂糖凝胶电泳
测序
Module und Variations_E 18
基因表达
选择表达系统
原核系统 真核酵母
动物细胞
植物细胞
构建表达载体
重组克隆载体
目的基因亚克隆
表达载体
正确的ORF
(以上两项过高，易出现星号活性）
双酶切反应：
(1)双酶切缓冲液 (2)先低盐,后高盐
Module und Variations_E 6
琼脂糖凝胶电泳 Agarose Gel Electrophoresis
Module und Variations_E 7
酶切反应与电泳技术
应用举例
(1) 基因酶谱分析
转化宿主: JM109 DH5 TG1 (competent cell ) 重组子的筛选与鉴定
Module und Variations_E 13
Amp Tet
pBR322
重组子的筛选与鉴定
插入片段
Baidu Nhomakorabea
Tet平板
抗药性标志的选择
Amp平板
Module und Variations_E 14
重组子的筛选与鉴定－蓝白筛选
Sept.2,2006
organ
tissue
cell
Molecular Biology
DNA
RNA
In which level we know about the life ?
Protein
what we are trying to do ?
1.To repress the mutant /pathogenic genes and inhibit its production 2.To Correct the mutants and enhance the normal ones
How to know the role of the gene of interest plays in
the life activities furtherly ?
Knock out （基因敲除）
Locus of interest gene in the genome
Module und Variations_E 8
酶切反应与电泳技术
（２）鉴定DNA分子量
(3)胶回收纯化DNA
low- melt agarose
Module und Variations_E 9
酶切反应与电泳技术
生物信息学分析酶切位点
Module und Variations_E 10
酶切反应与电泳技术
导入细胞: 化学方法（CaCl2)、电转化 、显微注射、 基因枪
外源基因表达: 化学诱导、温度诱导
基因表达检测: SDS-PAGE 、RT-PCR、Western Blot
Module und Variations_E 19
转基因动物过程示意图
Module und Variations_E 20
Module und Variations_E 21
(3) 基因治疗与疫苗的核酸 (超纯) 亲和层析，去除热源(内毒素)
DNA纯度: OD260/OD280= 1.7~1.8
Module und Variations_E 5
酶切反应与电泳技术
2. 酶切反应与电泳技术
限制性内切酶酶切反应 （ Restriction Endonucleases） 酶量: 1μ g:1U/1h 通常用量 ：5倍 甘油浓度：不超过5%
Am
lacZ
宿主菌
N2H
N片段
C片段
COOH
（ß-半乳糖苷酶）
原理
Module und Variations_E 15
X-gal
原理 Lac Z
蓝色化合物
重组子
Module und Variations_E 16
（LacZ基因 N端 序列）
LacZ基因 N 端序列
LacZ酶
插入片段
（LacZ基因失活）
Restriction map for the gene of trefoil family factor 2
Module und Variations_E 11
3. 基因重组与表达技术
基因来源:
酶切片段
mRNA
cDNA (RT-PCR)
PCR产物
化学合成：单链寡核苷酸
互补寡核苷酸链退火时, 注意温度变化要非常的缓慢,有利
But How ?
Module und Variations_E 2
Molecular Biology
分子生物学技术
1. 核酸的提取与纯化
5. 核酸杂交与基因芯片技术
2. 酶切反应与电泳技术 3. 基因重组与表达技术
Technique for
Nucleic Acid
6. 反义核酸技术与 RNAi 7. 基因组研究技术与平台
Molecular Biology Technology
Gene mRNA
Translation at ribosome
Protein
Jiankun Huang lab Center of Zhongshan Hospital Affiliated to Xiamen University, China
膜过滤法（对抗冷冻的全血） 磁珠提取法（不用离心、酚／氯仿 、乙醇)
Module und Variations_E 4
核酸的提取与纯化
核酸纯化
(1) PCR扩增产物
电泳
胶回收 (去除非特异性扩增产物、 dNTPS ，引物 Taq酶）
(2) DNA载体及重组子（大于20kb)
易污染宿主染色体断裂成的大分子DNA片段 用切割线状及开环的DNA,对闭合的DNA无作用的 Plasmid safe ATP- dependent DNAase
4. PCR与荧光定量PCR技术
8. 核酸与蛋白质相互作用研究技术
Module und Variations_E 3
核酸的提取与纯化
1. 核酸的提取与纯化
材料选择: 丰度高、容易提取的组织（组织、全血、血清、质粒）
提取过程: 破细胞 去杂质
浓缩
纯化
选择方法
酚抽提法
(注:当酚被氧化成醌，显红色, 会使核酸降解)
于寡核苷链完全正确互补成双链 (95℃
自然冷却至室温)
Module und Variations_E 12
克隆重组
克隆载体的选择
抗生素双抗性载体： pBR322( amp+, tet+) 互补筛选: pUC19 pBluecript II
基因与载体的连接 外源片段与载体的比例： 平端 (3-10):1，粘端 1:1