金银花 消毒方法

金银花组织培养外植体灭菌方法探索

文明玲,乐正碧,徐茜,王良平,黎华,张涵

（重庆三峡农业科学院，重庆万州 404155）

摘要：为了寻求金银花外植体的最佳灭菌方法，以灰毡毛忍冬新品种‘金翠蕾’为材

料，选用5种不同灭菌处理方法，对组培过程中的污染率、萌芽率、褐变率进行调查

统计。结果表明，紫外灯照射配合使用75%碱化乙醇消毒处理能显著降低外植体污染

率、提高萌芽率；75%碱化乙醇在降低污染率中起主导作用；试验筛选出最佳消毒方法

为：紫外灯照射30min，75%碱化乙醇处理30s，0.1%升汞灭菌8min。

关键词：金银花；组织培养；灭菌方法

金银花（Lonicera Japonica Thunb）为忍冬科忍冬属植物，又名二花、银花，为多年生半常绿腾本植物，对环境适应性强, 在我国各地均有广泛分布,现已大规模人工栽培种植[1-2]。金银花花蕾含有绿原酸、黄酮类、挥发油及无机元素等多种成分,具有抑菌消炎、清热解毒、保肝利胆、延缓衰老、增强人体免疫力等多种功效，最近研究表明金银花还具有良好的抗癌、抗艾滋病和预防“SARS”病毒作用, 是良好的药用植物资源，被广泛应用于制药、香料、化妆品、保健食品、饮料等领域[3-6]。

扦插繁殖和播种繁殖是金银花的常用繁殖方式，但这两种繁殖方式所得金银花种苗易携带病毒、细菌，植株生长不良，金银花产量下降，有效成分积累减少，产品品质降低。采用组培快繁技术能进行种苗的规模化生产繁殖。金银花以组培方式繁育不仅繁殖速度快、繁殖系数高，而且可以使植株脱毒，恢复品种的优良品性，更好地保持亲本原有品质。要通过组培方式进行金银花脱毒快繁，首先要获得无菌外植体材料，但由于金银花的茎段和芽体绒毛较多，采用常规的消毒方法难以彻底杀灭真菌、细菌。因此，探索金银花外植体的有效灭菌处理方法已经成为获取组织培养成功的前提条件。

1 材料与方法

1、1实验材料供试材料为灰毡毛忍冬新品种‘金翠蕾’，是西南地区商品金银花主要品种之一。75%碱化乙醇由体积分数为75%的乙醇与质量分数为40%的NaOH 按100:1的体积比例配制而成。所用激素为a-萘乙酸（NAA），6-苄基嘌呤（6-BA）。试验于2010年4-6月在重庆三峡农科院生物技术中心组培室进行。

研究。

1、2外植体预处理 2010年4月晴朗的上午，待露水完全蒸发后采取带对生腋芽的金银花幼嫩枝条，剪去叶片，自来水下冲洗30min，用虑纸吸干表面水分，将带对生腋芽的幼嫩茎段剪成1-2cm长备用。

1、3 试验方法在超净工作台上，将准备好的金银花带芽茎段置于紫外灯下照射0min、30min、60min，然后用乙醇表面消毒30s，无菌水冲洗3次，最后用0.1%升汞消毒8min，无菌水冲洗4-5次。试验设有5个处理，每处理40个外植体， 3次重复。灭菌处理：A：75%乙醇处理30s+0.1%升汞消毒8min；B：紫外灯照射30min+75%乙醇处理30s+0.1%升汞消毒8min；C：75%碱化乙醇处理30s+0.1%升汞消毒8min；D：紫外灯照射30min+75%的碱化乙醇处理30s +0.1%升汞消毒8min；E: 紫外灯照射60min+75%碱化乙醇处理30s +0.1%升汞消毒8min。

14培养条件培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，添加0.6%琼脂和3%蔗糖，PH值5.8-6.0。将已经灭菌的外植体接种在培养基上，培养温度28℃，光周期为16h/d，光照强度2000lx。接种15天后调查杂菌污染瓶数，30天后调查芽诱导瓶数。

2结果与分析

2.1 不同灭菌处理的灭菌效果

试验结果显示，D、E两处理的灭菌效果最好，污染率分别为28.2%和30%，其次为C处理，污染率43.3%， A、B两个处理的污染率均很高，分别为84%和72.8%。紫外线照射配合使用75%碱化乙醇进行表面灭菌的D、E两处理的污染率显著低于没经紫外线照射的C处理，极显著低于用75%乙醇消毒的A、B两处理。从本试验结果得出，碱化乙醇在灭菌效果上起主要作用；紫外灯照射虽然能降低污染率，但如果不配合使用75%碱化乙醇，其污染率将仍然很高；紫外灯照射30min已能降低外植体污染率，再延长照射时间不能进一步降低污染率，而紫外线照射时间过长易引起幼嫩组织发生变异。因此，低污染率的最佳灭菌方法为D处理。

2.2 不同灭菌处理对腋芽萌发的影响

各处理中，D、E两处理间的萌芽率未达显著差异，没经紫外灯照射的C处理萌芽率55%极显著低于E处理63.3%，显著低于D处理40.8%，经75%乙醇消毒灭菌的A、B两处理萌芽率分别为1.7%、2.5%，两处理间未达显著差异，极显著低于75%碱

化乙醇灭菌处理C、D、E。可见，使用75%碱化乙醇进行金银花外植体表面灭菌处理可显著提高其萌芽率，仅通过紫外灯照射处理而不配合使用75%碱化乙醇表面消毒，其萌芽率仍然很低。

2.3不同消毒处理对外植体褐变的影响

试验结果显示，75%碱化乙醇处理C、D、E的褐变率虽比75%乙醇处理A、B高，经方差分析，各处理间褐变率差异未达显著水平。可见，75%碱化乙醇对外植体进行消毒处理不会增加外植体褐变率；是否进行紫外灯照射和照射时间长短对外植体的褐变也没有显著影响。

综上所述，在金银花带腋芽幼嫩茎段灭菌过程中使用紫外灯照射和75%碱化乙醇表面消毒处理能降低外植体污染率，提高萌芽率，不会使外植体褐变率升高，其最佳灭菌方法为：紫外灯照射处理30min后用75%碱化乙醇进行表面消毒处理30s，最后再用0.1%升汞灭菌8min。

表1 不同消毒方法处理后的污染率、褐变率、萌芽率

处理污染数污染率 % 褐变数褐变率 % 萌芽数萌发率 %

A 36.8 91.8aA 2.3 5.8aA 0.67 1.8cA

B 35.3 88.3aA 2 5aA 1 2.5cC

C 17.3 43.3bB 3 7.5aA 16.3 40.8bB

D 11.3 28.2cB 3.3 8.3aA 22 55aAB

E 12 30cB 2.7 6.8aA 25.3 63.3aA

3讨论

1、灭菌剂的选择组织培养过程中外植体常规消毒法一般用75%乙醇配合0.1%升汞消毒。由于金银花植株外表长有疏柔毛和疏腺毛，茎段中空[7]，用常规消毒法将很难彻底杀灭病菌，如赵贤慧等（2007）研究表明，用75%乙醇配合0.1%-0.2%升汞对带腋芽的茎段消毒后的污染率高而且成活率低8]；也有研究报道用氯酸钠、次氯酸钙代替升汞对金银花外植体进行消毒，但灭菌效果均不如升汞理想[8-9]。在本试验中发现，用75%碱化乙醇代替75%乙醇进行表面灭菌能取得较好的灭菌效果。其原因可能是碱化乙醇中的OH-可改变细胞膜表面所带电荷的性质，增加膜的通透性，从而提高乙醇、升汞杀菌效果。

2、灭菌程序的选择当紫外线照射微生物时会穿透其细胞膜和细胞核，破坏DNA的分子键，使其失去复制能力或活性。将金银花带芽茎段置于紫外灯下照射能