动物细胞工程制药技术

动物细胞工程制药技术

摘要

生物制药产业以基因工程、抗体工程、细胞工程为主要代表。文章主要讲述动物细胞工程技术。动物细胞工程制药是动物细胞工程技术在制药行业方面的应用。当前动物细胞工程所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞器特别是细胞核移植技术、染色体改造技术、转基因动植物技术和细胞大量培养技术等方面。

关键词：动物细胞工程制药细胞融合细胞大规模培养核移植

1、动物细胞工程制药技术

1、1.细胞融合

细胞融合指在诱导剂或促融剂作用下，两个或两个以上的异源细胞或原生质体相互接触，进而发融合并形成杂种细胞的现象。细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一，不仅在农业、工业的应用领域不断扩大，而且在医药领域也取得了开创性的研究成果，如单克隆抗体、疫苗等生物制品的生产。在动物体细胞融合技术的基础上 Kohler G和 Milstein C将能产生特异性抗体的原代 B 淋巴细胞与肿瘤细胞进行融合，创立了单克隆抗体制备的方法。国内外已培育出了许多具有很高实用价值的杂交瘤细胞株系，它们能分泌用于疾病诊断和治疗的单克隆抗体，如甲肝病毒、抗人 I g M 、抗人肝癌和肺癌、抗M-CSFR（Macrophage Colony-Stimulat-ing Factor Receptor，巨噬细胞集落刺激因子受体）胞外区的单克隆抗体等。目前单克隆抗体技术已趋成熟，许多产品已经进入产业化的生产阶段。

此外利用细胞融合技术可以生产各种免疫疫苗，肿瘤细胞 / 树突状细胞融合疫苗是近年来国内外恶性肿瘤免疫治疗研究的热点, 在各种动物模型及病人身上观察到肿瘤的消退。Avigan 等将乳腺癌或肾癌病人的自体癌细胞与树突状细胞在含有人粒 - 巨噬细胞集落刺激因子、白介素 - 4 的自体血清中培养，加入聚乙二醇使两种细胞产生融合, 融合细胞疫苗能使肿瘤消退，显示其在肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。

1、2.转基因动物

利用转基因动物乳腺反应器生产药用或食品蛋白是生物制药领域近年来研究的热点之一。因为乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响到转基因动物本身的生理反应，从转基因动物的乳汁中获取的目的基因产物，不但产量高、易提纯，而且表达的蛋白经过了充分的修饰加工，具有稳定的生物活性，因此又被称为动物乳腺生物反应器，所以用乳腺表达人类所需蛋白基因的羊、牛等产量高的动物就相当于一座药物工厂。20 世纪 80 年代中期，英国科学家克拉克首先在鼠的乳腺组织高效表达了人抗胰蛋白酶因子基因，开创了研制动物乳房生物反应器的先河。

据美国遗传学会预测，到2010年，所有基因工程药物中利用动物乳房生物反应器生产的份额将高达95％。国外现已有数十家以动物乳腺反应器为核心技术的公司，可生产α 1 －抗胰蛋白酶、人红细胞生成素、乳铁蛋白、人血清白

蛋白、人血红蛋白及人凝血因子Ⅸ、Ⅷ和抗凝血酶Ⅲ、血纤维蛋白原、t P A 等十余种稀有药品，但只有为数极少的几种药用蛋白上市。2006 年 6 月，由美国Genzyme 转基因公司研制成功的世界上第一个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物棗重组人抗凝血酶Ⅲ（商品名：ATryn 牋）已经获准上市。

我国自 1998 年在国家“863 ”计划中将“转基因动物乳腺生物反应器”作为重大研究项目以来，也取得了一些较好的成绩。1996 年研制成功的能在乳腺中表达人凝血因子、EPO 的转基因羊；1 998 年曾溢滔等获得了能表达人血清白蛋白的转基因奶牛; 2 0 0 0 年中国农业大学与北京兴绿原生物技术中心合作，成功获得了我国首例转有人 a l 一抗胰蛋白酶基因的转基因羊1131；2005 年中国农业大学和北京济普霖生物技术有限公司联合研制的人乳铁蛋白和人乳清白蛋白转基因奶牛均获得高效表达，含量分别达到 3.4 克 / 升和 1.5 克 / 升，标志了我国首次获得可商业化生产的动物乳腺生物反应器重组人类蛋白。目前科学家们正在加紧开展重组蛋白纯化、临床前试验和临床试验等研究，力争早日实现我国动物乳腺生物反应器制药技术产业化。

1、3.细胞核移植技术

细胞核移植技术，是指将一个动物细胞的细胞核移植至去核的卵母细胞中，产生与供细胞核动物的遗传成份一样的动物的技术。科学家们已经先后在绵羊、小鼠、牛、猪、山羊等动物上获得胚胎细胞核移植后代，目前，体细胞克隆也在牛、山羊、小鼠等物种上均获得了成功。若将转基因与细胞核移植技术获得的克隆动物工厂相结合，在生物制药方面具有巨大的潜在应用价值。1998 年，Rohl 等用非静息期胎儿或纤维细胞成功克隆出 3只健康、同类的携带外源标记基因的转基因克隆。Schnieke 等用此法成功克隆出 3 只携带有人凝血因子Ｉ X 基因转染绵羊早期胎儿成纤维细胞，以该细胞系为供体移植到去核卵母细胞中，经过电和化学刺激后，将卵母细胞植入假孕母绵羊体内发育，获得这 3 只绵羊，这 3 只绵羊能高水平地表达人凝血因子Ｉ X （125 μ g/ml ）。Cibelli等同样也获得3头转基因牛。这些研究展示了转基因克隆动物技术的可能性，为细胞工程制药带来了光明前景。

1、4.动物细胞大规模培养

动物细胞的大规模高效培养技术是生物制药的关键技术，通过动物细胞培养生产生物产品已成为全球生物工业的主要支柱。目前动物细胞培养生产较多的生

物制剂是蛋白和抗体，通常采用中国仓鼠的卵巢细胞，事先将能产生某种蛋白质药品的基因片段与仓鼠卵巢细胞的 D N A 融合．再在培养液中大量培养它们、最后得到所需药品。与微生物发酵法比，虽然产量相对较低。但设备费用节省得多，如属于小品种、小产品类生物工程产品，可采用此法。

目前用于动物细胞体外培养的生物反应器有机械搅拌式、气升式、中空纤维式、回转生物反应器等。国外占主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养，为提高细胞的产率，可采用流加或灌注培养及微载体培养等相关技术。美国Genentech 公司使用 CHO 细胞以 12,000L 搅拌式生物反应器培养槽生产 t - P A 重组蛋白以及治疗癌症的生物药物。美国 G i b c o 公司建立的流加悬浮培养 rCHO 表达 r β Gal 系统，采用化学修饰的无蛋白 C H O 细胞培养基并增加 T C A 循环，生物反应器中活细胞密度最高可达 107cell/ml。国内第四军医大学采用5L CelliGen 反应器连续灌注培养杂交瘤细胞，培养第 9 天细胞密度达到8 × 106cells/ml 以上[17]。目前国内未见有万升级的生物反应器用于生产的报道，同时我国有关商品化大规模动物细胞反应器产品还处于空白，有待于进一步改进现有生物反应器设计或设计新型的生物反应器。

2、制造实例

如今，利用动物细胞生产的生物制品已日益增多。美国自1996年以来批准的33个产品中有25个是用动物细胞生产的。下面就几个在动物细胞工程制药的发展史上具有重要意义的产品进行介绍。

2、1 类淋巴细胞干扰素

类淋巴细胞干扰素是由一株从Burkitt淋巴瘤的患者获取Namalva细胞生产的干扰素，它含80%左右的IFN-α，20%左右的IFN-β。该干扰素首先由英国的Wellcome公司的Fante和Finter等开发成功，并扩大至8000L罐生产。该产品1986年先在英国获准进入市场，商品名为“Wellferon”。1999年Wellferon获美国FDA批准进入美国。该干扰素获准生产在动物细胞发展技术史上是一个很重要的里程碑，因为这是第一个获准用肿瘤细胞系生产的人用药品。

类淋巴细胞干扰素的生产工艺大致如下：先将细胞逐级放大直至4000L或8000L罐，培养基用RPMI1640培养基，加10%小牛血清。培养方式主要是搅拌式批次培养，当细胞密度达1×106/ml时，加入2nmol/L丁酸钠起动48h，接着用仙台病毒（50HAU/ml）诱生，18h后冷却至5～10 ℃，收集培养液，连续离心分离细胞，对上清液进行分离纯化。