哺乳动物转基因技术研究

哺乳动物转基因技术研究
摘要介绍了转基因哺乳动物的研究概况，综述了哺乳动物转基因技术基本方法，外源基因的整合和表达，转基因哺乳动物的检测方法以及哺乳动物转基因技术的应用和存在的问题。

关键词转基因哺乳动物；外源基因；转基因技术
20世纪70年代开创的DNA重组技术已被广泛的应用在生命科学的各个研究领域，并取得了丰硕的研究成果。

转基因哺乳动物自20世纪80年代初诞生以来，一直是生命科学研究和讨论的热点，随着研究的不断深入和实验技术的不断完善，转基因技术得到了广泛的应用。

转基因技术是20世纪遗传学中继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆之后的第4代技术，是生物学领域发展史上126年中14个转折点之一。

1转基因哺乳动物的研究概况
1980年Gordon等首先采用受精卵原核注射方法，将疱疹病毒基因SV40DNA 片段和PBR322原核DNA分别注射到小鼠受精卵的雄原核内，移植受体后获得了相应的转基因小鼠。

1982年Palmiter等又将带有小鼠MT启动子的大鼠生长激素基因（rGH）导入小鼠受精卵，得到了21只小鼠，其中7只带有目的基因，有6/7的小鼠比同窝对照组生长快近2倍，这些快速生长的转基因小鼠被誉为“超级小鼠”（super mouse），表明整合了的外源基因可以在宿主体内得到有效正确表达，表达产物可以在宿主动物体内行使正常的功能。

自此便掀起了培育转基因动物的大潮，按照研究转基因小鼠的思路，转基因兔、转基因绵羊、转基因猪、转基因山羊及转基因牛都陆续育成。

特别是1997年英国罗斯林研究所克隆羊“多莉”的诞生，突破了有性生殖的框架，表明高等动物也可以由无性生殖来繁殖。

同年美国PPL公司和罗斯林研究所合作，利用该法生产出具乳腺表达人第九因子的绵羊[1]。

利用转基因克隆技术获得了克隆猪、体内含有外源基因的转基因猪、体内有2个基因被“关闭”了的转基因克隆猪和基本不含人体免疫排斥基因的“基因敲除”克隆猪等[2]。

我国从1984年开始转基因动物研究，并于同年最先获得了含人B2珠蛋白基因的转基因小鼠。

1985年和1986年又分别获得了含人生长激素（MT2hGH）
基因的转基因泥鳅和小鼠。

1987年获得含有大肠杆菌galk和gpt基因的转基因小鼠。

以后又相继获得了含HbgAg乙型肝炎表面抗原基因的转基因兔、转基因猪、含EPO基因和人乙型肝炎表面抗原基因2种乳腺特异性表达的转基因山羊、含人凝血因子IX的转基因山羊、含人血清白蛋白基因的转基因奶牛、含“生物钢”蛋白基因的转基因老鼠[3]。

2哺乳动物转基因技术基本方法
2.1物理方法
主要包括显微注射法、电激法、超声波法、冻融法、基因枪法等，其中以显微注射法使用最为广泛，多数转基因动物是通过该方法获得的。

显微注射法是用微吸管在显微操作仪下将一定量的外源基因直接注入到受精卵的雄原核中，将受精卵培养后移植给受体动物。

1980年Gordon将SV40的TK基因整合后的质粒以显微注射法注入小鼠受精卵原核中，首次成功地培育出转基因小鼠，随后利用该方法，转基因兔、猪、绵羊、鱼、牛和山羊也都相继获得成功。

这种方法的优点是：外源基因易整合入染色体，导入的基因大，可使用任何载体承载基因片段，也可注射无载体的基因片段，外源基因的长度不受限制，可达100Kb，实验周期相对比较短。

但这一技术还存在明显不足，由于基因整体进入染色体的随机性，使外源基因整合位点和拷贝数无法控制，需要昂贵精密的设备，操作复杂，需培训专门技术人员。

尽管如此，由于其直接对基因进行操作，整合率较高，因而仍是目前建立转基因动物极为重要的方法。

2.2化学方法
主要包括磷酸钙沉淀法、多聚阳离子试剂法、脂质体包埋法和DEAE-葡聚糖法。

目前，脂质体包埋法是最佳的选择。

脂质体是由双分子层组成的闭合囊泡，通过细胞的内吞作用，将所携带的目标基因导入细胞中。

自Felgner等（1987）首次用DOTMA/DOPE阳离子脂质体介导基因转染培养细胞成功以来，取得较大进展，通过此方法获得了转基因山羊、绵羊、牛[4]。

该方法效率很高，离体细胞可以瞬时表达外源基因，但其作用机理尚未完全阐明。

Kawaura等（1998）发现，抑制细胞内吞的物质（如细胞松驰素）可最大程度地抑制转染，说明转染机制可能是细胞内吞。

该技术的优越性表现在细胞毒性低，对外源基因片段大小无特殊要求，且脂质体易于制备，尤其是免疫原性低，可在体内转染时使用与体外实验相同的载体。

目前，面临的主要问题是转染靶向性不强，易被吞噬细胞清除，血清的抑制作用以及转化效率低等。

2.3生物方法
主要包括反转录病毒法、精子载体法、原生质介导法、细胞融合法、胚胎干
细胞（Embryonic Stem Cell，ESCs）法和人工酵母染色体载体法。

2.3.1反转录病毒法。

反转录病毒是病毒中的一个大科，其成员可感染许多不同种属的动物。

它与其他病毒的区别在于其复制是通过一个DNA中间体，即前病毒来完成的。

中间体是反转录病毒生命周期的一个组成部分。

反转录病毒携带的反转录酶，能以RNA病毒基因组作为模板产生双股的DNA拷贝，单一拷贝能有效地插入宿主细胞的基因组中。

反转录病毒具有能将其病毒基因插入宿主细胞染色体中的能力，加上其能对多种细胞类型的非溶解性感染，使之成为基因转移实验的理想载体。

并且利用反转录病毒的高感染效率和在DNA上高度整合的特性，可以提高生产转基因动物的效率。

早在1974年，就有关于反转录病毒作为动物基因转移载体的研究。

Janenisch等将SV40DNA注入小鼠囊胚腔中，发现获得的小鼠体内有SV40DNA整合。

随后，他又成功地用鼠白血病病毒作为载体，将外源基因导入小鼠胚胎。

Harvey等用猫白血病病毒作为载体，成功地将外源基因导入去透明带的羊胚胎中[5]。

Anthony等认为以反转录病毒载体介导的基因整合的关键在于有丝分裂时出现的核膜分裂，处于减数分裂中期的卵母细胞无核膜的时间远长于处于有丝分裂M期的细胞，这就为反转录病毒载体介导的基因插入提供了可能[6]。

反转录病毒感染法的优点是操作简单，无需特别的仪器设备，外源基因的整合率较高，效果稳定，通常外源基因是单拷贝整合到受体基因组中，而且转染不受胚胎发育阶段限制。

动物病毒所具有的启动子不但可以引发一些选择标记基因的表达，还能引发所导入外源基因的表达[7]。

这一技术的缺点在于外源基因难以植入生殖系统，成功率较低；病毒衣壳大小有限，不能插入大的外源DNA 片断；感染宿主时，为非同源整合，结合不稳定；调控区内可能会发生相互作用，这就要求选择能稳定整合表达的外源基因，并用高感染力的反转录病毒作载体；最关键的是携带外源基因的病毒载体在导入受体细胞基因组过程中有可能激活细胞DNA序列上的原癌基因或其他有害基因，安全性令人担扰。

2.3.2精子载体法。

精子载体法是将成熟的精子与外源DNA进行预培养后，使精子携带外源基因，受精后并使外源基因能整合到受精卵染色体中。

此项技术在实际操作中存在许多问题，但在思路上对大型动物的转基因研究具有重要的意义，目前，在猪、鸡、鱼类等的基因转移中已获得成功，关键之处在于精子与外源DNA的结合[8]。

2.3.3ESCs法。

ESCs法是将目的基因转移入ESCs后，再重新导入囊胚或经筛选后对转入外源基因的ESCs进行克隆，从而培育出转基因个体。

ESCs法的最大特点是，在克隆的ESCs被转移到动物胚胎之前，可先把外源重组DNA整合到细胞的染色体组中，然后将这些胚胎干细胞进行筛选，找到理想的ESCs，从而大幅提高转基因动物的生产效率。

但ESCs法的缺点是ESCs建株很困难，同时还需要预先选择和克隆基因转移型细胞。

目前，利用该方法生产转基因动物有2个最大限制条件，一是只有小鼠的胚胎干细胞可供商业应用；二是即使有了胚胎干细胞，对家畜来说繁殖嵌合体还有一定困难。

2.3.4人工酵母染色体载体法。

人工酵母染色体载体是近年来发展起来的新
型载体，具有克隆百万碱基对级（Mb）大片段外源基因的能力，可以保证巨大基因的完整性，保证所有顺式作用因子的完整并与结构基因的位置关系不变，从而使得较长的外源片断在转基因动物研究中整合率的提高，另外，目的基因上下游的侧翼序列可以消除或减弱基因整合的位置效应[9]。

技术关键为：胚胎干细胞转染YAC后体筛选，阳性胚胎干细胞囊胚腔的注射，YAC原核注射[10]。

1996年BermG通过此法获得转基因兔[11]。

3外源基因的整合和表达
3.1外源基因的整合
外源基因的整合受DNA构型、进入宿主细胞的方式、DNA的浓度等的影响。

外源基因进入细胞后整合方式不同，可分为随机整合与定点整合。

整合一般具有稳定性，大部分以孟德尔方式遗传后代，少部分嵌合体，极少转基因未整合到染色体上，而是以附加体形式存在，并可传至后代。

1～100拷贝的外源基因以头尾成串的方式整合到宿主细胞的染色体上，一般为单位点整合，有时在不同染色体的不同位点整合。

目前，认为基因表达的强弱与整合的拷贝数无关，而与整合位置有关。

另外，原核生物的载体序列可能会抑制某些基因的表达，少数基因位点的侧翼序列有重排现象，或基因部分整合情况。

外源基因插入常出现宿主基因序列的重排、缺失、重复或异位，转基因可能会造成宿主细胞基因突变出现新表现型，有时会影响管家基因以至发育致死[12，13]。

3.2外源基因的表达
从基因到蛋白是一个多因素作用的生化过程，尤其是对随机插入宿主染色体的外源基因，其表达与否或表达程度强弱除受其本身结构影响外，整合位点的位置及附近顺式调控元件的有无都对外源基因表达产生影响。

另外，转基因沉默、RNA的错误剪接、原核载体序列及动物的遗传背景等也是外源基因不表达或表达水平低的原因。

外源基因表达很大程度上受整合位点的影响，所谓“位置效应”即是因整合位点不同而导致的基因表达差异。

对位置效应最直接的解释是插入位点附近的序列特点影响了其表达的程度[14]。

比如，如果外源基因插入转录失活的异染色质区域，则其表达有可能受到完全抑制。

目前，使用的酵母人工染色体（YAC）介导转基因，因保证了目的基因上下游侧翼序列的完整性，可在一定程度上减弱位置效应。

3.3提高外源基因表达的策略
3.3.1导入大片段目的基因。

YAC载体是近年来发展起来的新型载体，它的
大容量为处理大片段DNA提供了有力的武器。

YAC载体不存在位置效应，因YAC载体的大容量能保证巨大基因的完整性，保证所有顺式作用因子的完整性，另外，目的基因上下游的侧翼序列可以消除或减弱基因整合后的“位置效应”而引起缓冲区域的作用，从而提高外源基因的表达水平。

3.3.2添加内含子。

结构基因有3种形式：一是基因组基因，包括外显子和内含子；二是微型基因，也是基因组基因，但大部分的内含子都已去除；三是不包含内含子的cDNA。

大量的试验结果表明，基因组DNA在转录迁移方面优于cDNA及微型基因。

Grosveld等研究人β-球蛋白基因在转基因鼠中表达时发现，第2内含子对于表达是必需的，而采用cDNA构件，由于缺乏内含子，外源基因在转基因鼠中未能激活，在所进行的转录迁移实验中，采用含有内含子的基因组构件比采用cDNA的表达率提高表达10～100倍，说明内含子有利于基因的转录[12]。

3.3.3利用启动子和增强子。

启动子是RNA聚合酶进行精确有效转录必需的。

在转基因动物研究中如何选配设计启动子是决定外源基因在受体细胞中能否正确表达的关键环节。

有时为了增强基因的特异表达，还必须设计出单一型增强子或复合型增强子与之匹配[12]。

3.3.4利用反式作用因子。

动物基因的表达除受到顺式作用元件作用外，还受到反式作用因子的调节。

这些反式作用因子是可扩散并能与调控序列结合的蛋白因子或激素类物质，是由调控序列结构基因以外的基因编码的，在顺式元件的调控序列上有其特异的结合位点，是调控序列实现基因表达调控过程中不可缺少的功能性分子。

反式作用因子不仅能激活不同外源基因的转录，而且能结合到染色体的不同位点。

将一个基因的调控序列与另一个基因的结构序列重组可以产生新的组织特异表达，1个反式作用因子可以对几个基因的表达起作用，同时它也具有组织特异性[13]。

3.3.5添加基质附着区。

基质附着区（Matrix Attachment R-egion，MAR）又称核骨架附着区（Scaffold Attachment R-egion，SAR）。

S/MAR是指染色体上能专一性地与核骨架结合的DNA片段，该区域为A T丰富区，通常含拓扑异构酶II保守序列。

S/MAR有时能显著增强基因表达、克服位置效应和消除转基因沉默，它已越来越多的被作为一种重要的顺式调控元件应用在转基因工程中。

3.3.6利用基因打靶系统实现外源基因的定点整合。

转基因动物中外源基因在染色体上的整合状态与该基因的表达调控关系极大。

一般情况下，外源基因几乎全部都以随机插入的方式整合在受体细胞中染色体的随机位点上，因而几乎所有的转基因动物都面临遗传稳定性差、易引起插入突变和基因修饰并导致遗传病变等问题[14]。

近年来，国内外在这方面作了大量工作，设计出了多种基因打靶系统，使外源基因在受体细胞中定点整合在特异染色体的其特异位点上，从而基本上消除了随机整合带来的问题。

另外，基因打靶与胚胎干细胞培养系统结合，可方便地将各种突变引入生物体内，从而在整体水平上研究高等真核生物基因的表达调控。

4转基因哺乳动物的检测方法
检测方法通常采用的是不同层次的分子杂交法，如基因水平的DNA印记法（Southern Blot）、转录水平的RNA印记法（Northern Blot）、翻译水平的蛋白质印迹法（Western Blot）、聚合酶链式反应法（PCR）、斑点杂交法（Spot Hy-bridization），也可采用基因定位法（Gene Location），一般情况下多种检测方法联合使用。

4.1DNA印记法（Southern Blot）
DNA印记法是转基因动物鉴定的主要方法，也是目前最具权威的方法。

技术要点为：提取组织DNA，选择导入基因中的单一限制酶位点，酶切后电泳，转膜并选择适当的探针进行杂交，通过放射自显影获得结果。

优点是结果明确可靠，缺点是操作繁琐、工作量大。

4.2聚合酶链式反应法（PCR）
该法需设计一对特异性引物，以提取组织DNA为模板进行PCR扩增，检测是否有特异性片段。

由于PCR方法有时存在假阳性，特别是扩增出的内源性片段对转基因的筛选影响较大时，假阳性更明显。

因此，如何消除PCR假阳性是一个重要问题。

4.3斑点杂交法（Spot Hybridization）
提取待检动物组织DNA点于硝酸纤维素膜上，用探针杂交，放射自显影后获得杂交结果。

该法存在一些问题，如整合的外源基因与内源性基因有同源性时，往往出现假阳性。

另外，由于提取的染色体脱氧核糖核酸较为浓稠，加之整合拷贝数低，杂交效果有时不太理想。

因此，该法虽十分简单，但很少用于转基因动物筛选[15]。

5哺乳动物转基因技术的应用及存在的问题
动物转基因技术应用正走向产业化的道路，具有十分广阔的前景。

如动物转基因技术可用来改良动物品种[16]，提高生产性能，生产药物蛋白[8]，用转基因动物的器官作为人类器官移植的供体，建立诊断、治疗人类疾病及新药筛选的动物模型[17]。

但作为一个新兴的技术，转基因动物研究还面临着一些亟需解决的问题。

如转基因动物的成活率低；转基因动物在获得生产性状提高的同时，也留下一些后遗症[18]；转基因动物生物反应器所生产产品的安全性问题，对大自然生态平衡以及物种的多样性产生的不良影响，转基因动物器官移植可能会增加“人畜共患”病的传播机会；转基因动物技术带来的伦理道德问题等。

虽然转基因的研究仍存在诸多问题，但不可就此否定转基因技术的研究价值。

相信随着研究工作的深入进行，这些问题将会逐步得到解决。

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