优势菌的筛选及其生理生化特性的检测

摘要:通过稀释分离和平板划线法从鸡的排泄物中分离出5株微生物菌株,然后分别测定其生理生化特性和鸡粪定植实验。实验表明:a3为细菌,其余4株均为酵母菌,其中a4菌株具有较强的产蛋白酶、水解淀粉的能力,在鸡粪中定植效果最好,是比较理想的优势菌株

关键词:酪素;微生物分离;发酵鸡粪;定植

1 引言

畜禽养殖环境污染深化是严重的社会问题并逐渐受到人们的广泛关注,我国集约化畜禽养殖业起步比较晚,但发展十分迅猛,养殖业一方面给广大农户带来丰厚的收入,但另一方面畜禽养殖场排放的大量而集中的粪尿和废水已成为许多城市和农村的新污染源[1]。禽畜粪便已成为固体有机废弃物的主要来源。不论是规模化的养鸡场还是散养的农户,随着规模的不断扩大,鸡粪的污染成了养鸡业和农户最关心的问题。虽然目前在尽力减少对环境造成的污染,但是在实际生产中不少养殖单位和农户在鸡粪综合利用上依然不尽人意,因此鸡粪的处理和利用显得尤为重要。国内外的研究表明[2],鸡粪中含有丰富的营养物质[3]。向鸡粪中添加特定的微生物菌群,能有效地促进有机物降解,加速鸡粪腐熟进程,同时还有利于消除致臭物质,减轻对环境的污染[4]。本实验从发酵鸡粪中分离5株优势菌群,并对其生理生化特性进行检测,旨在为鸡粪资源的合理利用,生产高质量的有机肥料奠定基础。

2 材料与方法

2.1 实验材料

供试材料中的新鲜鸡粪取自南充某养殖场。分离用培养基包括牛肉膏蛋白胨培养基(分离细菌);20%鸡粪抽提液加1.5%琼脂(分离放线菌);pda培养基(分离真菌)。摇瓶发酵培养基为20%的鸡粪抽提液。

2.2 试验方法

2.2.1 菌株的分离纯化

将新鲜鸡粪用无菌水稀释成浓度为10??-2?的溶液,采用平板稀释法将鸡粪涂抹在不同类型的固体分离平板培养基上,置于30℃恒温培养箱内培养。3d后挑取分离平板上的单菌落,并进一步采用平板稀释分离法纯化,然后将特征不同的菌落分别接种于相应的斜面培养基上培养,并保存备用。

2.2.2 菌种的筛选

将所有分离得到的菌株,以10%接种量接种到鸡粪抽提液液体摇瓶发酵培养基中(装量100ml/500ml)100rpm培养。3d后接种划线到相应的平板上,培养2d后,挑取单菌落保存。

2.3 筛选菌株的生理生化鉴定

2.3.1 淀粉水解实验

将保存菌种逐个点种在淀粉水解培养基上,30℃培养3d,滴入少量lugol?s碘液于平皿中,轻轻旋转平板,使碘液均匀铺满整个平板。最后记录实验结果。若菌落周围出现无色透明圈,说明淀粉被水解,透明圈的大小反映水解淀粉的能力。菌株水解能力以公式u?p=(d/d)?2计算。式中d为透明圈直径(mm),d为菌落直径。

2.3.2 酪素水解实验

分别挑取少许菌种,先接种含酪蛋白的斜面培养基,再点接于酪蛋白的平板,30~32℃培养24~48h,测定平板上菌苔直径和水解圈的直径[5]。

2.3.3 油脂水解实验

将溶化的固体油脂培养基冷却至50℃左右时,充分摇荡使油脂分布均匀。无菌操作倒入平板,待凝。用记号笔在平板底部标上菌名。然后将菌种用无菌操作划成“十字”接种于平板的相对应部分的中心。然后将平板倒置,于37℃温箱中培养48h后,取出平板,观察并记录菌苔颜色,如出现红色斑点,为脂肪水解阳性,记为“+”,否则为阴性,记为“-”。

2.3.4 产硫化氢实验

用接种针将菌种接种于醋酸铅培养基中,置37℃培养48h。观察并记录颜色变化,出现黑色者为释放硫化氢,深浅反映释放的量[6]。

2.3.5 过氧化氢酶实验

将菌种接种于相应的斜面培养基上,30℃培养24h。然后滴入3%h?2o?2 数滴于斜面菌体上,若有气泡为阳性。

2.3.6 有机酸实验

将菌株分别接种到两支葡萄糖蛋白胨培养基中,培养2d后,将1支葡萄糖蛋白胨水培养基内加入甲基红试剂2滴,培养基变为红色者为阳性,变黄色者为阴性,甲基红试剂不宜加得太多,以免出现假阳性[7]。

2.4 筛选菌株的形态鉴定

对筛选菌株的形态进行镜检及染色分析,具体项目有革兰氏染色、芽孢染色、鞭毛染色等。

2.5 菌株鸡粪定殖试验

将适量发酵液与500g灭菌鸡粪搅拌均匀,菌数控制在10?4个/g左右,控制水分在50%左右。装入内径为8cm,深为12cm的灭菌陶土盆(底部通气孔),上面罩以薄塑料(防止水分散发过快) 。50℃恒温发酵,间隔2d 取样,用稀释平板法测定活菌数。

3 结语

通过本次实验从鸡粪中筛选出5株菌株分别命名a1~a5,经过镜检其中a3为细菌,其余4株为酵母菌。

3.1 淀粉水解实验

5株菌株中有3株能分解淀粉,其中a4菌株分解淀粉的能力最强u?p值达到28,a1和a5菌株不具有分解淀粉的能力,见图1。

图1 不同菌株水解淀粉能力的up值比较

3.2 酪素水解实验

由图2可知,a3菌株和a5菌株不具有分解酪素蛋白的能力,而其余3株均有降解酪素的能力,其分解能力的大小依次为a4>a2>a1。

图2 不同菌株水解酪素能力的up值比较

3.3 油脂水解实验

5株菌株中只有a5菌株具有降解油脂的能力,占分离菌株的20%。

3.4 产硫化氢实验

所分离的5株菌株,都能不同程度产生硫化氢。根据产生硫化氢的深浅判断产生硫化氢的能力为:a3>a1>a5>a2>a4。

3.5 过氧化氢酶实验

分离的5株菌株中,有2株微生物能分解过氧化氢,分别是a2和a3.占分离菌株的40%。

3.6 有机酸实验

在分离的5株菌株中,a3菌株具有加入甲基红以后培养基变红,呈阳性,说明其具有产有机酸的能力。

菌株在鸡粪中的定殖试验结果5个菌株在鸡粪中的定殖试验结果见表1。各菌株在接种第4d至第6d菌数增加最快,这与鸡粪堆肥从第4d进入高温期第7d降温相一致。在这期间鸡粪化学成分发生很大变化,是有机物降解、除臭和脱水的关键时期。其中菌株a1、a2、a4菌数增长较快。

4 结语

本试验从自然鸡粪堆肥中分离筛选出5株优势菌,分别对5株菌进行淀粉水解实验、酪素蛋白水解实验、定植实验等其中a4株细菌具有较强的分解蛋白能力,并且能在鸡粪中很好地