免疫共沉淀技术路线
免疫共沉淀步骤
免疫共沉淀步骤在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。
Input是断裂后的基因组DNA,需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。
Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。
1.1.1免疫沉淀1)蛋白提取(1)取10盘长满10cm大皿的HepG2细胞，弃去培养基，用预冷PBS清洗细胞3次，吸净PBS残液。
(2)加预冷的裂解液(含蛋白酶和磷酸酶抑制剂)至培养皿中(每皿500-1000ul),冰上孵育30min。
(3)用细胞刮刮取，收集细胞裂解液并移至离心管，4c离心13,000g,10min。
(4)将上清移至新离心管中，可用于蛋白浓度测定或远期研究。
2)准备磁珠(1)将proteinA和proteinG珠子分别摇晃5min混悬，各吸取50ul珠子到1.5mlEP管中，组成100ul珠子混合物。
(2)小离心机离心20-30s,去上清。
3)结合抗体(1)将肝细胞癌患者血清20ul和200ulAbBinding&WashingBuffer加入上述EP管中。
(2)室温旋转10min孵育。
(3)小离心机离心20-30s,去上清。
(4)力口入200ulAbBinding&WashingBuffer,轻柔吹打重悬珠子。
4)免疫沉淀(1)将上述EP管离心，去上清。
(2)取5ml蛋白裂解液轻柔吹打重悬珠子-抗体复合物。
(3)室温旋转孵育30min(将抗原结合到珠子-抗体复合物上)。
(4)离心机离心20-30s,将上清吸入干净离心管备用。
(5)使用200ulWashingBuffer清洗珠子-抗体-抗原复合物3次，即轻柔重悬、离心去上清3次。
(6)100ulWashingBuffer重悬珠子-抗体-抗原复合物，将混悬液移至干净EP管。
免疫共沉淀技术原理和操作流程
三、纯化与检测 经蛋白质与DNA 解偶联，DNA片段纯化
等处理后，用PCR等方法检测DNA与蛋白质的结合情况.
注意事项
条 超声波破碎条件的选择
件 选
抗体量的选择
择 PCR反应条件的选择
对 Input对照
通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性 地富集目的蛋白结合的DNA片段
对目的片断的纯化与检测
操作步骤
一、固定 在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质－DNA复
合物，然后用化学（微球菌酶）或者机械（超声波）的手 段将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段。
二、免疫沉淀 利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗
，得到相应肽列标签 4.搜索数据库分析目的蛋白相关数据进行后续研究
染色质免疫沉淀 (CHIP)
➢ 研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要工具。 它不仅可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA 片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与 基因表达的关系。
CHIP原理
在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合 物
将其随机切断为一定长度范围内的染色 质小片段
优点和不足
优点
1.可以分离到天然状态的相互作用蛋白复合物 2.蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避
免人为影响。
缺点和局限性
1.难以检测蛋白质的低亲和力和短暂的相互作用 2.不能够确定第三种蛋白的桥联作用
应用及实例
应用领域：
免疫共沉淀实验用途非常广泛，但一般主要用 于低丰度蛋白的富集和浓缩，为SDS-PAGE和 MS质谱分析鉴定准备样品。
免疫共沉淀技术
• 定义及原理 • 操作流程 • 优点和不足 • 注意事项 • 应用及实例 • 展望
免疫共沉淀详细操作方法
免疫共沉淀详细操作方法一、准备实验材料和试剂1.细胞培养基和细胞培养酶：根据实验需要选择不同种类的培养基和酶。
2.细胞系：选择适当的细胞系，如HEK293T细胞等。
3.抗体：选择特异性强、亲和力高的单克隆或多克隆抗体。
4. 蛋白提取缓冲液：例如，含10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、0.5% NP-40等。
5.磷酸盐缓冲液：例如，PBS（含1.5mMKH2PO4、6.5mMNa2HPO4、137mMNaCl、2.7mMKCl，pH7.4）。
6. 免疫共沉淀缓冲液：例如，含50 mM Tris-HCl（pH7.4）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、0.5% NP-40、5%甘油。
7.带有亲和树脂的免疫沉淀缓冲液：例如，蛋白A或蛋白G亲和树脂结合的PBS。
二、细胞处理和蛋白质提取1.培养细胞：将细胞培养在合适的培养基中，并在37℃、5%CO2的培养箱中培养至适当的细胞数。
2.细胞刺激：根据实验需要，将细胞进行刺激处理，如药物刺激、细胞因子刺激等。
3.细胞裂解：将培养的细胞用蛋白提取缓冲液裂解，放在冰上离心，使细胞溶解并得到细胞裂解液。
4.蛋白质含量测定：使用BCA或其他合适的方法测定细胞裂解液中蛋白质的含量。
三、制备免疫复合物1.免疫数据：将所需的抗体预先装载到蛋白A或蛋白G亲和树脂上。
2.预清洗亲和树脂：将亲和树脂与免疫共沉淀缓冲液混合，使其均匀混合，然后以适当的速度离心，去除上清液。
3.免疫共沉淀：将适当量的蛋白质样品加入预清洗的亲和树脂和免疫共沉淀缓冲液中，使其充分混合，并以适当的速度旋转培养，使抗体与目标蛋白结合形成免疫复合物。
4.温和洗涤：使用免疫共沉淀缓冲液轻轻洗涤免疫复合物，以去除非特异性结合的蛋白质。
四、蛋白质沉淀1.洗涤亲和树脂：使用洗涤缓冲液多次洗涤亲和树脂，以去除非特异性结合的蛋白质。
免疫共沉淀步骤
免疫共沉淀步骤1什么是免疫共沉淀？免疫共沉淀（简称IP）是一种使用免疫学原理来检测特定分子间相互作用的技术。
它是一种常用的实验技术，常用于生物学研究，包括分子生物学，细胞生物学和基因组学等。
它可用于确定因子之间的作用关系，如蛋白或核酸之间的结合，表达调节，功能调节和其他。
2IP的基本步骤免疫共沉淀的主要思想是在石英沉淀浴里添加一种抗体，其特异性与正在研究的蛋白质结合，而余下的蛋白质（相异蛋白）则不能结合。
IP实验的主要步骤包括：(1)免疫化学：使用合适的抗体特异性地捕获特定的蛋白质；(2)沉淀（夜来香）：以石英粉为纤维，使之沉淀；(3)异常洗涤：除去不被特异性结合的蛋白质；(4)蛋白质抽提：可以使用多种方法抽提从石英沉淀中捕获的蛋白质；(5)结果分析：可以使用多种技术，如SDS-电泳、酶标，来测定从石英沉淀中捕获的蛋白质。
3免疫共沉淀的优势IP是一种高灵敏、高特异性和简单方便的实验方法，可用于检测未知的相互作用，相比其他常用的技术，IP的优势在于：(1)IP可以从大量的蛋白质中发现潜在的互作，并能够物种不受限地检测相关表达物；(2)IP是一种免去合成cDNA，PCR或逆转录实验就可以实现的方法，可以用于处理灵活性较低的克隆或者微量量级样品；(3)无论是从克隆库中检测还是在单个样品中检测，IP实验都可以做出及时有效的结果；(4)IP测试可以将相互作用的蛋白质，核酸或糖蛋白鉴定为两种特异性能结合的表位。
4总结免疫共沉淀为蛋白质之间高特异性的相互作用提供了一种可靠的方法。
同时，IP实验非常简单，可以在极低的量级下有效地检测蛋白质。
妥善操作IP实验，足以揭示蛋白质自身的特性，从而深入研究生物体中分子间的相互作用，提供若干让我们更进一步地研究。
染色质免疫共沉淀(ChIP)实验具体方法及步骤
染色质免疫共沉淀（ChIP）实验具体方法及步骤在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。
IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天）1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。
2. 37℃孵育10 min。
3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。
450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。
混匀后，在室温下放置5 min即可。
4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。
预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。
6. 倒去上清。
按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。
使得细胞终浓度为每200ul含2x106个细胞。
这样每100 ul溶液含1x106个细胞。
再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设MCF7长满板为5x106个细胞。
本次细胞长得约为80%。
即为4x106个细胞。
因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。
将2管混在一起，共800 ul。
7. 超声破碎：VCX750，25%功率，4.5 s冲击，9 s间隙。
共14次。
二、除杂及抗体哺育（第一天）1. 超声破碎结束后，10 000 g 4℃离心10 min。
去除不溶物质。
2. 留取300ul做实验，其余保存于-80℃。
3. 300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M），65℃处理3 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤
免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose 的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。
免疫共沉淀详细操作方法
免疫共沉淀详细操作方法免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）是一种常用的蛋白质亚细胞定位、相互作用以及鉴定蛋白质结构和功能的实验方法。
它基于抗体与特定的抗原的非共价结合，通过这种特异性识别和结合，可以将目标蛋白质从混合溶液中富集出来。
下面将为您详细介绍免疫共沉淀的操作步骤：1.制备样品：-收集需要分析的生物样品（如细胞或组织），并在冰上快速移至离心管中，避免样品被降解。
-加入细胞裂解液：将离心管放入冰上，加入细胞裂解液（含有蛋白酶抑制剂）使细胞完全裂解。
-离心：将样品进行离心，去除细胞碎片和细胞核等杂质。
- 确定样品浓度：使用蛋白质浓度检测方法，如BCA法或Bradford 法，测定样品中的总蛋白质浓度。
2.抗体偶联：-预处理蛋白A/G琼脂糖磷酸盐瓶：向蛋白A/G琼脂糖磷酸盐瓶中加入足够的磷酸盐缓冲液，摇匀致溶，并将其放置在冰上。
-加入抗体：根据需要添加用于免疫共沉淀的抗体到磷酸盐缓冲液中，每次添加约10-20μg抗体。
-偶联抗体：将抗体与蛋白A/G琼脂糖磷酸盐瓶中的磷酸盐缓冲液混合，放置在冰上静置30分钟以上。
- 离心：将含有抗体的磷酸盐缓冲液进行离心，去除沉淀，得到滴度为1mg/mL的液体。
3.预结合抗体与琼脂糖的结合：- 加入琼脂糖磷酸盐瓶：将经离心的滴度为1mg/mL的抗体溶液加入含有蛋白A/G琼脂糖磷酸盐瓶中，放置在冰上静置过夜。
-离心：离心管中的混悬物进行离心，除去上清液，得到含有预结合抗体的固体。
4.免疫共沉淀：-加入样品：将样品加入到含有预结合抗体的蛋白A/G琼脂糖磷酸盐瓶中，放置在冰上静置2-4小时或过夜，使抗体结合到目标蛋白质上。
-离心：将混合物进行离心，去除上清液。
-洗涤：加入洗涤缓冲液，使混合物重悬，轻轻混匀，然后离心去除上清液，重复此步骤2-4次。
-溶解蛋白质或沉淀：根据需求，可以选择加入蛋白酶抑制剂和PBS 溶解蛋白质或沉淀物。
5.应用：-SDS-：使用SDS-技术，将免疫共沉淀的样品和对照样品进行分离。
免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法
免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法免疫沉淀和免疫共沉淀是一种常用的实验技术，用于分离和富集特定的抗原-抗体复合物。
这两种技术在生物医学研究中广泛应用，有助于揭示蛋白质的相互作用、分子机制以及疾病的发生和发展过程。
下面将详细介绍免疫沉淀和免疫共沉淀的原理和方法。
免疫沉淀是利用抗体的高度特异性与需要研究的抗原结合，然后通过添加固相或固体材料，使抗原-抗体复合物沉淀。
这样可以将目标蛋白质从混合溶液中分离出来，以便于后续的分析和检测。
免疫沉淀的原理可以分为两个步骤：第一步是抗体与目标抗原的结合，第二步是利用固相或固体材料将抗原-抗体复合物沉淀。
免疫沉淀的方法通常包括液相免疫沉淀和固相免疫沉淀两种。
液相免疫沉淀方法是将抗体与需要研究的抗原混合，形成抗原-抗体复合物。
然后通过添加沉淀剂如聚乙二醇（PEG），将复合物沉淀下来。
沉淀后，可以通过离心将沉淀物与上清液分离。
固相免疫沉淀方法则是在固相材料如蛋白A/G琼脂糖或蛋白A/G磁珠上固定抗体，然后将抗原样品添加到固相材料中，形成抗原-抗体复合物。
复合物通过洗涤去除非特异性结合的物质，然后通过洗脱或酸性条件解离，将目标蛋白质分离出来。
免疫共沉淀是通过利用亲和层析柱或免疫磁珠结合多个抗体分离多个蛋白质复合物的技术。
与免疫沉淀不同的是，免疫共沉淀使用多个抗体同时结合多个蛋白质，以便于研究这些蛋白质之间的相互作用。
免疫共沉淀的原理与免疫沉淀相似，不同之处在于使用了多个抗体来捕获目标蛋白质。
免疫共沉淀的方法通常包括两个步骤：首先，在样品中添加多个抗体，形成抗原-抗体复合物。
然后使用亲和层析柱或免疫磁珠，将复合物沉淀下来。
与免疫沉淀类似，免疫共沉淀也可以使用液相或固相方法进行。
但是，由于需要结合多个抗体，免疫共沉淀的操作更加复杂。
总结起来，免疫沉淀和免疫共沉淀是一种基于抗体特异性的实验技术，用于富集和分离特定的抗原-抗体复合物。
免疫沉淀主要用于从混合溶液中分离目标蛋白质，免疫共沉淀则用于分离多个蛋白质复合物。
染色质免疫共沉淀步骤
染色质免疫共沉淀步骤
染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是一种用于研究蛋白质与DNA 相互作用的技术。
以下是一般的染色质免疫共沉淀的基本步骤：
1. 细胞固定：将细胞培养物在适当的条件下进行固定，以维持DNA-蛋白质复合物的结构。
2. 细胞裂解：使用细胞裂解液将细胞破碎，释放出染色质。
3. 抗体结合：将特异性抗体加入到裂解液中，使其与目标蛋白质结合。
4. 免疫沉淀：使用抗体-抗原复合物的特异性结合，通过免疫沉淀的方法将与抗体结合的染色质-蛋白质复合物沉淀下来。
5. 洗涤：对沉淀进行多次洗涤，以去除非特异性结合的物质。
6. DNA 提取：将沉淀中的DNA 提取出来。
7. DNA 分析：对提取的DNA 进行分析，例如PCR、芯片分析或高通量测序等，以确定与目标蛋白质结合的DNA 区域或基因。
需要注意的是，具体的实验步骤可能会因实验目的、细胞类型和使用的试剂而有所不同。
在进行染色质免疫共沉淀实验时，建议遵循相关的实验方案和标准操作流程，并根据实际情况进行优化和调整。
此外，染色质免疫共沉淀技术需要一定的实验技能和经验，包括细胞培养、抗体选择、洗涤条件的优化等。
免疫共沉淀 方法
免疫共沉淀方法
免疫共沉淀方法是一种用于检测蛋白质相互作用的实验技术。
该方法主要包括以下步骤：首先将需要检测的蛋白质与特异性抗体结合形成复合物，然后将该复合物与一些磁性或珠状的颗粒结合，使其沉淀下来。
随后，对沉淀下来的蛋白质复合物进行洗涤去除非特异性结合物，最终用一些方法将其分离并进行检测。
通过这种方法，可以检测蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA/RNA等相互作用关系，是目前广泛应用于生物医学领域的一种技术。
- 1 -。
免疫共沉淀技术流程
免疫共沉淀技术流程一、免疫共沉淀技术的准备工作。
1.1 首先呢，得把要用的材料都准备齐全喽。
这就好比做饭得先把食材都买好一样。
我们需要有合适的细胞或者组织样本，这是整个实验的基础。
细胞或组织要是没选对，那可就像盖房子地基没打好，后面全白搭。
1.2 还有抗体，这抗体啊，那可是免疫共沉淀技术里的关键角色。
就像一把精准的钥匙，要能特异性地识别我们感兴趣的蛋白质才行。
要是抗体选错了，就像拿错钥匙开错门，啥都做不成。
另外，像蛋白A或者蛋白G琼脂糖珠这些试剂也不能少，它们在后面的步骤里起着重要的作用呢。
二、细胞裂解。
2.1 细胞裂解这一步可不能马虎。
要使用合适的裂解缓冲液，这缓冲液就像是一种神奇的溶剂，能够把细胞里的蛋白质都释放出来。
就好像把一个装满宝藏（蛋白质）的盒子打开一样。
裂解的条件得控制好，温度啊、时间啊，都得恰到好处。
要是裂解过度了，就像把宝藏都给弄碎了，蛋白质结构被破坏，后续的实验就没法好好进行；要是裂解不完全呢，那很多蛋白质还被困在细胞里，就像宝藏没全拿出来，也是不行的。
2.2 在裂解的过程中，还得添加一些蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
这就像是给蛋白质派了保镖，防止它们在裂解过程中被降解或者去磷酸化。
不然的话，我们想要研究的蛋白质可能就变得面目全非了，那可就前功尽弃了。
三、免疫共沉淀反应。
3.1 把裂解后的样品和特异性抗体混合在一起，这时候就像是一场精准的约会。
抗体要去找到它对应的蛋白质，然后结合在一起。
这个过程需要在合适的环境下进行，比如说合适的温度和搅拌条件。
就像约会得找个合适的地方，还得有点互动才行。
3.2 接着呢，加入蛋白A或者蛋白G琼脂糖珠。
这些琼脂糖珠就像是小磁铁，能够把和抗体结合在一起的蛋白质复合物吸附过来。
这一步就像是用网把约会的一对儿（抗体蛋白质复合物）给捞起来一样。
然后经过离心等操作，把吸附了复合物的琼脂糖珠沉淀下来，而那些没有结合的东西就被去掉了，就像把杂质都筛掉，只留下我们想要的精华部分。
免疫共沉淀技术路线
免疫共沉淀技术路线免疫共沉淀技术当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的蛋白质—蛋白质间的结合被保持下来，因此可用于检测和确定生理条件下相关的蛋白质—蛋白质相互作用。
如果实验目的是检测两种特定蛋白质是否在体内存在相互作用，第二种蛋白质通常用免疫印迹方法检测；如果实验目的是发现新的结合蛋白，可以直接对胶上蛋白质进行染色来确定。
其实验步骤如下。
(1)用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。
刮去每块板上的细胞到1ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。
(2)将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4~C以最大速度离心15min。
(3)收集上清液(约30mi)并加入30ug的适当抗体，4~C摇动免疫沉淀物1h。
(4)加入0．9ml的蛋白质A—Sepharose悬液，4~C摇动免疫沉淀物30min。
(5)用含900mmol／LNaCl的NETN洗蛋白A—Sepharose混合物，再重复洗5次。
最后，用NETN洗1次。
(6)吸出混合物的液体部分。
加入800／Jl的1XSDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4min。
(7)将样品加入到大孔的不连续SDS—PAGE梯度胶中，在10mA的恒定电流下电泳过夜。
(8)如果实验目的是发现新的结合蛋白，通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。
对于实验目的是检测两种特定蛋白质是否在体内存在相互作用，第二种蛋白质通常用免疫印迹方法检测。
(9)如果实验目的是发现新的结合蛋白，从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1m1 50％乙腈洗两次，每次3min。
(10)用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。
通过窄孔高效液相色谱分离肽。
将收集的肽在ABl 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。
准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl“过渡抗体”（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer 洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。
免疫共沉淀原理及实验方法
免疫共沉淀原理及实验方法1.利用抗体的高度特异性与抗原结合，将抗原特异性地富集。
2.抗原-抗体复合物与磁珠或珠标记结合，通过磁力或离心作用将复合物分离沉淀下来。
1.材料准备：准备所需的细胞或组织样品，以及抗体、磁珠或珠标记等实验试剂。
2.细胞或组织提取：将细胞或组织样品裂解，并用适当的缓冲液重悬，获得蛋白质提取液。
3.抗体结合：将蛋白质提取液与所需的抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
4.沉淀：将磁珠或珠标记加入抗原-抗体复合物中，使其结合，再利用磁力或离心作用将复合物沉淀下来。
5.洗涤：用适当的缓冲液洗涤沉淀物，去除非特异性的蛋白质。
6. 分离与检测：将沉淀物分离出来并进行进一步的分析、检测，如Western blotting、质谱分析等。
1.高特异性：通过使用特异性抗体，可以选择性地沉淀目标蛋白质，减少非特异性的干扰。
2.高灵敏度：沉淀后的蛋白质富集度高，有利于进一步的鉴定和分析。
3.可用于分析蛋白质相互作用：通过免疫共沉淀技术，可以研究蛋白质与其他分子的相互作用关系，揭示机体内蛋白质功能和信号传导的调控机制。
免疫共沉淀技术在生命科学研究中扮演着重要的角色。
例如，通过免疫共沉淀可以研究蛋白质与DNA、RNA或其他蛋白质的相互作用关系，从而了解基因调控、信号传导和代谢途径等重要生物学过程的调控机制。
此外，免疫共沉淀还可以用于筛选靶蛋白质、鉴定疾病标志物，以及评估一些药物对蛋白质相互作用的影响。
综上所述，免疫共沉淀技术是一种重要的实验方法，通过利用特异性抗体与所要研究的蛋白质结合，实现蛋白质的富集、分离和鉴定。
该技术广泛应用于细胞生物学、分子生物学和疾病研究等领域，对揭示分子相互作用、信号传导机制和疾病发生发展具有重要意义。
免疫共沉淀(Co-IP)
1免疫共沉淀一、实验原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP），是利用抗原A 与蛋白B 结合，通过A 的抗体（钥匙）沉淀A （锁），再利用精制的prorein A/G （钥匙链）预先结合到磁珠上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，磁珠上的prorein A/G 就能吸附抗原，从而获得抗原A 与蛋白B 的复合体，之后就可以对B 进行检测，从而获得蛋白质与蛋白质相互作用的信息。
二、Co-IP 标准化操作流程样品裂解（裂解液）→样品的预纯化（normal IgG/微珠）→与目标蛋白抗体共孵育（IP 抗体、Normal IgG ）→免疫共沉淀（微珠）→微珠清洗（裂解液）→洗脱→WB 分析或其他分析（WB/一抗、二抗）（一）样品裂解 1.温和裂解（1）温和的裂解液进行裂解，常用的去垢剂成分：NP-40、TritonX-100、IGEPAL CA-630、CHAPS ；（2）成品buffer ；（3）添加蛋白酶抑制剂（防止蛋白被降解）。
2.样本制备流程（1）去掉培养基，用冰PBS 清洗一次。
2（2）去掉PBS，每个板（10cm ）中加0.5mL 冰预冷的1×细胞裂解液，在冰上孵育5min 。
（3）将所有细胞刮下，收集到离心管，置于冰上。
（4）冰浴中对样品用超声处理3次，每次5s 。
（此步骤对膜蛋白提取有较好作用） （5）4 ℃，14000g 离心10min ，将上清转移到新的离心管中，即为细胞裂解物。
（6）BCA 测定浓度。
3.注意事项（1）整个过程冰上操作。
（2）IP 样本一般建议新鲜制备并立即使用，如有需要，可保存在-80 ℃。
（二）预纯化 1.阴性对照的选择与IP 抗体同源同型（亚型）的抗体：如 Rabbit IgG ；Mouse IgG1等。
取与IP 实验等量的裂解液，使用Isotype Control 孵育；与IP 抗体孵育同时进行。
2.Isotype Control 选择3.预纯化的目的（1）减少裂解混合物中的非特异性蛋白的含量。
免疫共沉淀的原理及应用
免疫共沉淀的原理及应用1. 原理免疫共沉淀是一种常用的生物化学技术，用于检测蛋白质与其他蛋白质或分子的相互作用关系。
其基本原理是利用特异性抗体与目标蛋白质结合，然后将抗体与结合的蛋白质一起沉淀下来。
通过这种方法可以分离出与目标蛋白质相互作用的其他蛋白质或分子。
免疫共沉淀的步骤如下：1.样品制备：将待测的细胞或组织样品裂解，释放出蛋白质。
2.抗体结合：加入特异性抗体，将其与目标蛋白质结合。
3.免疫共沉淀：加入沉淀剂，使抗体与结合的蛋白质形成复合物，并沉淀下来。
4.洗涤：洗涤复合物，去除非特异性结合的蛋白质。
5.蛋白质释放：将目标蛋白质与与之相互作用的蛋白质从复合物中释放出来。
6.分析：通过Western blot、质谱等技术对释放出的蛋白质进行分析。
2. 应用免疫共沉淀技术在生物学研究中有着广泛的应用。
以下是几个常见的应用领域：2.1 蛋白质相互作用网络研究免疫共沉淀技术可以用于分离和鉴定与目标蛋白质相互作用的其他蛋白质，从而帮助构建蛋白质相互作用网络。
这对于研究细胞信号传导、蛋白质功能和疾病机制等方面具有重要意义。
2.2 蛋白质纯化和鉴定免疫共沉淀技术可以用于纯化目标蛋白质，特别是与其他蛋白质相互作用的复合物。
通过免疫共沉淀，可以去除其他干扰蛋白质，从而提高目标蛋白质的纯度。
此外，通过鉴定与目标蛋白质共沉淀的蛋白质，可以帮助研究者了解目标蛋白质的生物功能。
2.3 药物研发免疫共沉淀技术可以用于筛选与目标蛋白质相互作用的化合物，作为药物研发的候选。
通过免疫共沉淀，可以鉴定与目标蛋白质相互作用的小分子化合物，并评估其对蛋白质功能的影响。
这为新药物的研发提供了重要的依据。
2.4 信号转导途径研究免疫共沉淀技术可以帮助研究细胞信号转导途径中关键蛋白质的相互作用关系。
通过分析与信号转导途径相关的蛋白质复合物，可以揭示信号传递的分子机制，为疾病诊断和治疗提供新的思路。
3. 结论免疫共沉淀技术是一项重要的生物化学技术，通过特异性抗体与目标蛋白质结合，可以分离和鉴定与目标蛋白质相互作用的其他蛋白质或分子。
免疫共沉淀实验原理及详细步骤
免疫共沉淀实验原理及详细步骤研究蛋白之间相互作用必不可少的实验是免疫共沉淀(CoIP)，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分，因其具有可信度高的优点，在现在基础医学研究中广泛应用，本文将为您详解CoIP的实验原理和操作步骤，实验刚入门的同学必看哦。
一、实验目的1)检测两种目标蛋白是否在体内相互作用;2)找到与目标蛋白在体内存在相互作用的新蛋白。
运用这项技术，说不定你会有新的发现哦!二、实验原理CoIP是利用抗原蛋白和抗体的特异性结合、以及“Protein A/G"特异性地结合抗体(免疫球蛋白)FC段的现象开发出来的方法。
目前多用Protein A/G预先结合在Argarose Beads上，使之与含有抗原蛋白的溶液(如细胞裂解液)及抗体(诱饵蛋白X抗体)反应后，Beads上的Prorein A/G就能通过抗体吸附诱饵蛋白X，诱饵蛋白X通过与靶蛋白Y相互作用将其从细胞裂解液中分离出来，从而达到免疫共沉淀的目的。
三、实验材料细胞、RIPA缓冲液(RIPA buffer)、偶联有Protein A/G的免疫磁珠(Protein A/G Beads)、诱饵蛋白X与靶蛋白Y的抗体、IgG对照抗体、移液枪、4度冰箱以及低温离心机等。
四、实验步骤(不同实验室略有差异)1) 制备细胞裂解液：收集4x107细胞，用PBS洗涤后，加入1 ml RIPA buffer(含蛋白酶抑制剂)，充分混匀，冰上裂解30 min;4℃，12000 rpm离心10 min，收集上清液。
2) 免疫共沉淀：在细胞裂解液中加入50 μl 50% Protein A/G Beads，4℃翻转混合孵育1 h进行预清除，离心后取0.5 ml上清液，加入3 μg诱饵蛋白X抗体，另取0.5 ml上清液加入等量同源的IgG抗体作为对照，4℃摇晃结合过夜;第二天每管加入50 μl 50% ProteinA/G Beads，4℃摇晃结合3 h;用RIPA Buffer洗涤5次，每次5 min。
免疫共沉淀（Co-IP）技术流程
免疫共沉淀（Co-IP）技术流程一、免疫共沉淀（Co-IP）概述免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的ProteinA或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的原理开发出来的方法。
其基本原理是，为了研究细胞中蛋白A与蛋白B是否结合，在细胞裂解液中加入抗蛋白A的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Agarose珠上的ProteinA或G，若细胞中有与蛋白A结合的蛋白B，就可以形成这样一种复合物：“蛋白B—蛋白A—抗蛋白A抗体—agaroseProteinA或G”，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。
蛋白B然后经western blot或质谱检测目的蛋白。
蛋白A这种方法得到的蛋白B是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。
二、技术流程1、收集经过处理的细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30 min, 细胞裂解液于4°C，12000转离心30 min后取上清；2、取少量裂解液以备免疫印迹分析，剩余裂解液中加入适量的相应抗体，4 °C缓慢摇晃孵育过夜；3、取10μL protein A 或GAgarose珠，用适量裂解缓冲液洗3次，每次3000 rpm离心3 min；4、将预处理过的10 μl protein A 或G琼脂糖珠加入到经过与抗体孵育的细胞裂解液中，4 °C缓慢摇晃孵育2~4h，使抗体与protein A或GAgarose珠偶联；5、免疫沉淀反应后，在4 °C以3000 rpm 速度离心3min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1mL裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15 μL的3×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟；6、SDS-PAGE, 免疫印迹或质谱仪分析。
免疫共沉淀技术实验步骤
免疫共沉淀技术实验步骤免疫共沉淀实验大致流程为:收集蛋白样品—诱饵蛋白抗体沉淀诱饵蛋白—SDS-PAGE 分离蛋白—WB 检测是否存在靶蛋白。
实验步骤详解：一、细胞总裂解液的制备①转染后24h收集细胞，1400r X 3min，4°C离心，弃去上层培养基②冰上静置裂解细胞，加入预冷的非变性裂解液NETN(20mMpH8.0Tris HCl,100mMNaCl,1 mMEDTA,0.5% Nonidet P-40)吹打混匀，冰上静置10-15min。
注意NETN用时要现加蛋白酶抑制剂，通常是Leupeptin和Aprotinin这两种(终浓度为1ug/ml)③12000 x 5-10min, 4°C离心④将离心后的上清液转移至新的EP管内，每管转移的量保持一致，注意不要吸到底部沉淀，全程冰上操作二、免疫共沉淀①留取20ul左右细胞裂解的上清液加2 x loading buffer煮5min，作为input组②提前将琼脂糖凝珠(S beads)均分至新的EP管内，要使用剪去了尖头的枪头吸取beads，且保证每管里的beads量一致，小心吸去上清液，加入A蛋白的抗体和细胞裂解后的上清液。
1mg蛋白裂解液加入25ul悬浮液包括 1:1的 S beads与2ug A蛋白抗体③4°C摇床孵化2-4h(期间可以配制SDS-PAGE胶，准备下一步Western blotting)④Binding结束，1400r x 1min, 4°C离心⑤真空泵或移液枪吸去上清，注意不要吸到沉淀，加入800ul NETN，上下颠倒混匀，保证底部的沉淀悬浮起来⑥离心，重复4)5)，洗beads三次⑦最后一次弃去上清，用点样枪头将残液吸净，加15ul 2xloading buffer煮5min，作为Co-IP组点样，剩下的沉淀再次加入10ul 2 x loading buffer煮一次，作为IP组点样。
核酸蛋白质的免疫共沉淀
核酸蛋白质的免疫共沉淀1. 引言核酸蛋白质的免疫共沉淀是一种常用的实验技术，用于研究核酸和蛋白质之间的相互作用。
通过该技术，我们可以确定特定蛋白质与核酸的结合，并进一步了解它们在细胞功能中的作用。
本文将详细介绍核酸蛋白质的免疫共沉淀的原理、步骤以及实验注意事项。
2. 原理核酸蛋白质的免疫共沉淀是基于抗体的特异性结合原理。
首先，我们需要制备特异性的抗体，可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
这些抗体可以与我们感兴趣的蛋白质结合。
然后，我们将这些抗体与细胞或组织样品中的蛋白质进行反应，使抗体与特定蛋白质形成免疫复合物。
接下来，我们使用沉淀剂（如蛋白A/G琼脂糖或磁珠）将免疫复合物与其他非特异性的蛋白质一起沉淀下来。
最后，我们可以通过洗涤步骤去除非特异性蛋白质，并分离和检测目标蛋白质。
3. 步骤核酸蛋白质的免疫共沉淀通常包括以下步骤：步骤1：制备样品首先，我们需要从细胞或组织中提取核酸和蛋白质。
这可以通过细胞裂解和离心等步骤来完成。
提取的样品应该是纯净的，没有其他干扰物。
步骤2：抗体选择根据研究的目的，选择特异性的抗体。
这些抗体可以是商业化的抗体，也可以是自制的抗体。
确保抗体的特异性和亲和力。
步骤3：抗体偶联将选择好的抗体与适当的偶联试剂（如蛋白A/G琼脂糖或磁珠）进行偶联。
这样可以将抗体固定在固相材料上，方便后续的沉淀步骤。
步骤4：免疫反应将偶联好的抗体加入到样品中，与目标蛋白质进行免疫反应。
免疫反应的条件需要根据具体实验进行优化，包括反应时间、温度和缓冲液的选择等。
步骤5：沉淀在免疫反应结束后，添加沉淀剂（如蛋白A/G琼脂糖或磁珠）将免疫复合物与其他非特异性蛋白质一起沉淀下来。
这可以通过离心或磁力分离的方法进行。
步骤6：洗涤将沉淀下来的免疫复合物经过一系列洗涤步骤，去除非特异性蛋白质和杂质。
洗涤的缓冲液的选择需要根据实验要求进行优化。
步骤7：脱离将洗涤后的免疫复合物从固相材料上脱离下来，可以使用低pH或其他适当的方法。
免疫共沉淀步骤范文
免疫共沉淀步骤范文首先，进行样品制备。
样品制备是非常关键的一步，需要使用细胞培养技术收获足够的蛋白质。
通常情况下，我们要用研究对象的细胞系进行培养，将培养的细胞进行裂解，取得总蛋白质，以便后续实验的进行。
接下来，进行免疫沉淀。
免疫沉淀是通过特异的抗体和抗原之间的结合来纯化感兴趣的蛋白质。
这里抗体能识别蛋白质的特定区域，因此选择适当的抗体是很重要的。
通常选择目标蛋白质抗体进行沉淀，可以将其结合在固定在一种载体上的亲和试剂上，例如琼脂糖或磁珠。
然后将亲和试剂与细胞提取物进行孵育，以使抗体与目标蛋白质结合。
然后，进行凝胶电泳。
凝胶电泳是通过载体的孔隙结构将沉淀物从其他细胞成分中分离出来。
最常见的是聚丙烯酰胺凝胶电泳或SDS-。
SDS-可以将沉淀的蛋白质按大小进行分离，之后进行蛋白染色检测。
接下来进行蛋白质鉴定。
蛋白质鉴定是非常重要的一步，通过鉴定可以确定我们感兴趣的蛋白质和与之相互作用的分子。
常用的鉴定方法有质谱、Western blotting、ELISA等。
Western blotting可以检测特定蛋白质的存在或缺失，而ELISA可以通过特异性抗体的结合来定量特定分子的存在。
最后进行数据分析。
数据分析是对实验结果进行解读的步骤。
通过对比不同样品的结果，可以确定感兴趣的蛋白质与其他分子的相互作用。
此外，还可以利用一些生物信息学工具，例如Gene Ontology（GO）富集分析或Pathway分析，来进一步理解这些蛋白质之间的功能关系和信号通路。
综上所述，免疫共沉淀是一种用于研究蛋白质相互作用的重要实验方法。
它可以帮助我们了解蛋白质的功能、参与的信号通路和调控机制。
虽然操作过程较为复杂，但是通过合理设计和细致操作，仍然可以获得可靠的实验结果，为我们的科学研究提供有力的支持。
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4. 免疫共沉淀技术路线(CoIP)
2007-05-07 09:14
准备工作：
预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机
1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；
2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)
3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）
4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中
5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠
6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景
7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子
8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）
9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10μg/μl）
10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异
11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育
12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl“过渡抗体”（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）
13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS
14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混
匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道） 15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。
RIPA Buffer配制：
基础成分：
Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性）
NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集）
NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液）
去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存）
注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。
RIPA蛋白酶抑制剂
苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保
存）
EDTA（钙螯合剂；用H2O配制成100mM的储存液，PH 7.4）
亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）
抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分
装，-20℃保存）
胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存）
RIPA磷酸（酯）酶抑制剂
激活的Na3VO4（用H2O配制成200mM的储存液，见Sodium Orthovanadate Activation Protoco）
NaF（200mM的储存液，室温保存）
注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂
工作液配制：
配制100ml的modified RIPA buffe：
1. 称取790mg 的Tris-Base，加到75ml 去离子水中，加入900mg的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4
2. 加10 ml 10%的NP-40
3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清
4. 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存
5. 理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 µl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 µl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。
各种成分在工作液中的终浓度：
• Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4
• NP-40: 1%
• 去氧胆酸钠：0.25%
• NaCl: 150 mM
• EDTA: 1 mM
• PMSF: 1 mM
• 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 µg/ml
• Na3VO4: 1 mM
• NaF: 1 mM
通过免疫共沉淀确定结合蛋白
1．用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。
刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。
2．将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。
3．收集上清（约30 ml）并加入30μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1 h。
4．加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液，4℃摇动免疫沉淀物30 min。
5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。
最后，用NETN洗一次。
6．吸出混合物的液体部分。
加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min。
7．将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10 mA的恒定电流下电泳过夜。
8．通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。
9．从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次3 min。
10． 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。
11． 通过窄孔高效液相色谱分离肽。
将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。