第6章肿瘤细胞的培养

表8-1-2 抑制成纤维细胞生长的因
方 法 因 素 组 织 细 胞 胚胎小肠、心肌表皮 乳癌 各种肿瘤 转化细胞 表皮细胞 表皮 正常和恶性乳腺上皮结肠 癌 肾组织 乳腺 表皮 肝细胞 选择性附着 选择性附着底物 胰蛋白酶 胶原酶 聚丙稀酰胺 聚四氟乙烯 (Teflon) 胶原(猪皮) 小鼠3T3 人胎小肠 D-缬氨酶 (Valine) MCDB-710 MCDB-153 Phenobarbitone
汇合饲细胞层
百度文库选择性培养基
排除成纤维细胞 的方法
1.机械刮除法 • 用不锈钢丝末端的橡胶刮头(用胶塞剪成三角形 插入不锈钢丝或裹上少许脱脂棉制成)，装入试 管中高压蒸气灭菌后备用(也可用特制电热烧灼 器刮除)。操作步骤如下： (1)标记 镜下观察，用记号笔在培养瓶(皿)的背面 圈下肿瘤细胞的部位。 (2)刮除 弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶(皿)中， 在肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记细胞空间 。 (3)Hanks液冲洗1～2次，洗除被刮掉的细胞。 (4)加入培养基继续培养，如仍有成纤维细胞残留 ，可重复刮除至彻底刮净为止。
一、肿瘤细胞培养的生物学特性
1．形态和性状 2．生物特性 3．永生性 4．侵润性 5．异质性 6．细胞遗传性
• 肿瘤细胞形态不规则，细胞界限清晰，伸 展较差，核膜、核仁轮廓明显，核仁多、 核浆丰富。 • 折光性强，电镜观察细胞表面微绒毛多而 细密，与肿瘤细胞具不定向运动和铺着不 依赖性有关。
1．形态和性状
4．胶原酶消化法 • 本法是利用成纤维细胞对胶原较为敏感的 特点，通过消化进行选择。 (1)可用0.5mg/mL的胶原酶消化处理，边消化 边在镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉 后即终止消化。 (2)用Hanks液洗涤处理一次后，更换新培养 基，继续培养，可获纯净肿瘤细胞，若未 清除净，可再次重复。
(三)成纤维细胞的排除方法
• 在肿瘤细胞的原代培养中，常在培养物中混有 正常成纤维细胞，若把正常细胞误认为是癌细 胞，就会使整个工作失去意义，若不及时去除 这些成纤维细胞，由于成纤维比肿瘤细胞生长 快，最终能抑制肿瘤细胞的生长。 • 因此，尽早排除成纤维细胞，已成为肿瘤细胞 长期培养建系的关键。现已发现有许多因素能 抑制成纤维细胞生长(见表8-1-2)。 • 为了在肿瘤细胞中排除成纤维细胞，常采用五 种方法，即机械刮除法、反复贴壁法、消化排 除法、胶原酶消化法、密度梯度离心法。
三、肿瘤细胞的取材和培养
(一)肿瘤细胞的取材方法 • 培养肿瘤细胞的材料一般来自患者，对实 体瘤患者可取原发肿瘤组织或转移灶，有 胸、腹水患者可取胸水或腹水，白血病患 者可取血液或骨髓液进行培养。具体： (二)肿瘤细胞的培养方法
(一)肿瘤细胞的取材方法
1.体瘤取材方法 取术后或活检标本，要尽早浸入无血清培 养液保鲜，尽快进行培养。尽可能去除溃疡 及坏死组织，避免细菌、霉菌污染，对取自 外露的肿瘤组织，应在培养前在含二性霉素 B 2μg/mL，青霉素200～1000u/mL，链霉 素500μg/mL的培养液中浸泡10～20分钟， 再用洗液反复冲洗干净后，再作培养。
续表1
恶性肿瘤细胞 多角形或细长形， 伸展较差，折光强 ，核浆比例大，嗜 碱性强，核仁多、 大，常见多核巨细 胞 方向性消失，多层 重叠生长，接触抑 制消失，饱和密度 高
形 态
排列有方向性，单层 生长特性 生长，有接触抑制， 饱和密度低
表8-1-1 区别正常成纤维细胞 与恶性肿瘤细胞的常用指标 指 标 正常成纤维细胞
2．反复贴壁法 • 根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特 点，并结合使用不加血清的营养液，把含有 两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞 相互分离。方法如下(同贴壁传代)： (1)待细胞生长达一定数量后，倒去旧液，用 0.25%胰蛋白酶消化后，Hanks液洗2次，加 入不含血清的培养液吹打分散，制成单细胞 悬液。 (2)取三个培养瓶分别编号为A、B、C，首先把 细胞悬液接种入A瓶，置温箱中静置培养5～ 20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶 角后，慢慢吸出全部培养物，再接种于B瓶中 ，然后向A瓶中补充完全培养基置温箱继续培 养。
续表2
恶性肿瘤细胞
细胞间粘附性强， 细胞间粘附性弱 粘附性 紧贴壁生长 ，易脱落 血清的要求 必须有血清 无需血清能生长 在半固体琼 能生长，形成集 脂中生长能 不能生长 落 力 电子显微镜 核蛋白体较少，微 核蛋白体丰富， 观察 丝微管有规则排列 微丝微管消失
表8-1-1 区别正常成纤维细胞 与恶性肿瘤细胞的常用指标 指 标 细胞膜对低分 子物质通透性 粘多糖的合成 和分泌腺苷酸 环化酶活性 细胞内CAMP浓 度 对松孢菌素 的反应 致瘤试验 正常成纤维细胞 低 多 高 高
以5×108～10×108/L细胞浓度，在含有 10%小牛血清的RPMI1640、或Eagle MEM或DMEM中，在37℃ 5% CO2下分 瓶(或皿)培养
3.钽网培养法 • 在一张面积约为1cm2的钽网上放入上述剪碎的一 块或几块肿瘤组织块(1~2mm3大小) 用镊子轻 压，使其粘于网上 再把钽网放入培养皿中，使网下的组织块与皿壁紧 紧接触 于37℃ 5% CO2下培养，每隔2~3天换 液一次 5天后可见有上皮细胞从网上移出，并能在相 当于肿瘤组织部位形成纯净的单层上皮细胞。
续表3
恶性肿瘤细胞 高 少 低 低
不刺激核分裂， 核持续分裂，形 或至多形成双核 成多核巨细胞 细胞 不能形成肿瘤 能形成肿瘤
二、培养肿瘤细胞的生物学 特性的检测
• 体外培养的肿瘤细胞一旦建立细胞系就 需要进行一系列的细胞生物学特性鉴定. • 目的在于：①证明培养的细胞是否来自 原来的肿瘤细胞。②说明肿瘤组织类型 。③描述肿瘤细胞的生物学特性。 • 通常要检查下列项目：
4．侵润性
• 侵润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，体 外培养的肿瘤细胞仍保持有这种特性， 当与正常组织混合培养时，能侵润入其 他正常组织中，甚至能穿透人工隔膜。
5．异质性
• 所有肿瘤细胞都是由增殖能力、遗传性、 起源、周期状态等性状不同的细胞组成， 属于异质性，其中有的衰老、退化，有的 处于周期阻滞状态，只有那些处于活跃增 殖的肿瘤干细胞才是支持肿瘤生长的成分 ，肿瘤干细胞易于生长增殖，分离培养干 细胞的方法称干细胞培养(有干细胞系和数 个亚系组成)。
(二)肿瘤细胞的培养方法
• 肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严 格，一般常用RPM1640，DMEM、McCoy-5A等培养基，血清浓度不高，10%即 可，建议在原代培养时最好能加入生长因 子或原患者血清(1%～2%)以利细胞生长。 • 培养方法很多，主要有组织块法、酶消化 法、钽网法、脱落细胞法等。
(3)B瓶中的细胞静置培养5～20分钟后，按处 理A瓶的方法，把B瓶中的培养液和细胞悬 液吸出并注入C瓶中，再向B瓶补加完全培 养基，C瓶补加少量小牛血清(浓度为10%) 。 三个瓶一并在培养箱中培养，如操作成 功，次日观察，可见A瓶中主要为成纤维细 胞，B瓶中两类细胞混杂，C瓶中主要为上 皮细胞(癌细胞)，必要时可反复处理几次直 至癌细胞纯化为止。
2．生物特性
• 癌细胞在无血清或低血清(2%～5%)时仍 能生长，营养要求不高，因肿瘤细胞能 自分泌促增殖因子，在软琼脂培养时单 个细胞能形成集落，生长方向性消失， 再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增 多时可呈多层重叠生长，细胞饱和密度 大，有丰富的三极有丝分裂，分裂指数 高，细胞倍增周期短。
3．永生性
2.腔液的取材方法 在无菌条件下采取体腔液(胸水或腹水)， 不需加抗凝剂，可直接以1200r/min收集细胞 ，不要久置，也不要在冰中冷却，而应尽早 接种。 3.血液(骨髓)取材法 白血病患者可取血液或骨髓，主要以取外 周血为研究对象，用肝素抗凝的注射器无菌 抽取5～10mL外周血，置于试管中立刻分离 培养。
第六章
肿瘤细胞的培养
• 肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药 的敏感性、肿瘤细胞和癌分子生物学特 性的重要手段。 • 应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具 有许多优点：
①可免受机体内环境因素的影响，避免了个体差 异性，便于探索各种物理、化和生物因素对肿 瘤细胞生命活动的影响。 ②既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞的结构与功 能，又便于从基因及分子水平上研究癌变的发 生机理。 ③可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学 特性和遗传行为的改变。 ④可用于快速筛选抗癌药物和研究耐药机理。 ⑤研究周期短，比较经济。但是它也有缺点，如 长期培养可使细胞生物学特性发生改变；体外 实验所得的结果不能完全代表体内的情况，应 与体内试验结合研究更为合理等。
1.织块培养法 将取得的瘤组织去除脂肪\结缔组织及坏死部分 在平皿中用Hanks液洗3次 剪碎组织，切成1~2mm3小块 接种于事先涂有鼠尾胶原的培养瓶（或皿）中 37℃ 5%或加盖瓶塞在普通恒温箱中培养。
2.酶消化法 • 在上述的碎组织块中加入0.25%胰蛋白酶或 2000u/ml胶原酶 • 在37℃水浴中消化30分钟或更长一些，去 除消化液 • 用洗液洗3次，培养液洗1次后,用完全培养 基悬浮，并用吸管吹打分散制成细胞悬液 ，计数。
肿瘤细胞失去接触抑制现象
4.软琼脂培养：癌细胞在低密度下仍具有 高度存活率，并在软琼脂中形成集落。 5.细胞核型分析：检测核型特点，染色体 数量，有无标记染色体，染色体带型等 ，癌细胞大多为异倍体，多倍体，并有 标记染色体。
6.动物致瘤试验：裸鼠背部皮下接种 1×109~2×109/L癌细胞能生长形成实体瘤 ，其组织学形态与原发瘤相似。 7.组织化学检查： 癌细胞中脱氧核糖核酸、 酸性磷酸酶和磷脂增多，碱性磷酸酶下降 ，乳酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶活性也改变 。 8.其他生物学特性检测：有凝集试验等。
6．细胞遗传性
• 体外培养的肿瘤细胞失去了二倍体核型 ，呈异倍体或多倍体，常有标记染色体 出现。正常细胞与恶性肿瘤细胞的区别 ，如表8-1-1所示。
图 肿瘤的迁移
表8-1-1 区别正常成纤维细胞 与恶性肿瘤细胞的常用指标 指 标 正常成纤维细胞 棱形或多角形，伸展 良好，折光较弱，核 浆比例小，嗜碱性弱 ，核仁较少较小，多 核巨细胞少见
检查下列项目
1.组织起源：应说明培养材料起源于哪个胚层、 器官组织、什么样供体、何种疾病等，必要 时要提供病理诊断鉴定资料。 2.形态观察：观察细胞一般形态如细胞形状，核 浆比例倒置，有丰富的三极或多极有丝分裂 ，核仁清晰、多个，微丝、微管排列紊乱。
3.细胞生长特点：检测细胞生长曲线，细胞分 裂指数，倍增时间及细胞周期。癌细胞失 去正常的接触抑制，呈多层生长，生长旺 盛，倍增时间缩短，饱和密度大，分裂指 数较高，具无限增殖能力，细胞浸润能力 较强等。
3．消化排除法 • 此法曾用于乳癌细胞的培养，具体方法如下 ： (1)先是用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1:1) 混合液漂洗培养细胞一次，然后加入新的混合 液继续消化直到有半数细胞开始脱落时，立 即停止消化。 (2)把消化液离心弃去上清，沉下的细胞用培养 基重悬并吸入另一培养瓶中，置温箱培养， 向原瓶中补加新的培养基继续培养，此法处 理后，鉴于成纤维细胞比肿瘤细胞先脱落， 原瓶中留下的多为肿瘤细胞，经过几次反复 处理，就能把成纤维细胞除净。
4.脱落细胞法 • 将新鲜的肿瘤组织去除脂肪和结缔组织 洗液洗2次后 用刀片将肿瘤组织切成细薄片，在切割的同时有许多上皮细胞 脱落下来, 脱落细胞经洗涤后 加入完全培养基，便可获得较纯的上层细胞，于培养瓶(或皿)中 、37℃ 5% CO2下培养，每隔2～3天换液，7～10天上皮细胞 逐渐长成单层。
• 永生性也称不死性，在体外培养中表现为可无 限制传代而不凋亡(Apoptosis)，体外培养的肿 瘤细胞系(株)都表现有这种特性。 • 体外培养的永生性和体内肿瘤的恶性(包括侵润 性)是两种性状，受不同基因调控的，因恶性肿 瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功， 生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若干代， 说明体外培养的永生性可在体外培养后获得。 • 另外，体外培养的许多细胞系，如NIH3T3、 Rat-1 10T1/2等均具有永生性而无恶性。但两者 有相关性，永生性可能是细胞恶性变的某一阶 段。