免疫胶体金标记手册

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大学电子显微镜室大学生物技术研究所

胶体金免疫标记技术培训班

技术资料

胡东维洪健徐颖

大学

2001年10月

一、胶体金的制备

根据不同的制备方法，可以制备出直径1－500nm的胶体金粒子，但做为免疫标记探针，其直径应在3-30nm围。

在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。粒子直径每增加一倍，数量减少为原来的1/8。

以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径3～16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1～0.2％的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。

利用柠檬酸为还原剂，可以制备12～150 nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时，建议使用该方法制备12-16 nm直径的胶体金。

除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备5 nm的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，故该方法已经很少使用。

氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g或1g），因此在配制氯化金溶液时一次配完，暂时不用的可以用1.5 ml试管分装为1 ml保存（-20℃）。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化处理（1％双氯硅烷/氯仿浸泡1小时，烘干）。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用，不用时应密封保存，以防污染。

制备好的胶体金保存寿命较长，可4℃保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。

1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3～16 nm胶体金

(1)取一250 ml三角瓶，加入79 ml双蒸水和1 ml 1％氯化金，预热至60～70℃。

(2)取一50 ml烧杯，加入4 ml 1％柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积大小加入

不同用量的单宁酸及等量的25 mM K2CO3。预热至60～70℃。K2CO3的作用是保

持溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5 ml时，对pH的影响不大，K2CO3

可以省略。

(3)将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温10分钟。自然冷却。

柠檬酸钠（ml）单宁酸（l）胶体金（nm）

4 5000 3

4 2000 4

4 500 6

4 120 8

4 70 10

4 10 16

2、白磷还原法制备5 nm胶体金

(1)取250 ml三角瓶一个，加79 ml双蒸水，1 ml 1%氯化金，并用0.25 M K2CO3将

溶液调至中性（pH7.0）。

(2)取0.2 ml饱和磷/乙醚溶液加到1.5 ml试管中，再加0.8 ml乙醚，混匀。取0.7

ml加入溶液（1）中(磷有毒且易燃，操作请带手套，多余的磷溶液用CuSO4进行中和)。

(3)室温下轻轻摇匀15 min，然后加热沸腾并保持5 min，自然冷却。

3、柠檬酸三钠法制备12-30 nm胶体金(Frens, 1973)

(1)取250 ml三角瓶一个，加100 ml双蒸水及1 ml 1%氯化金，加热沸腾；

(2)取不同量的1%柠檬酸钠加入上述溶液中。混匀，再保持沸腾30 min，溶液颜色首

先变黑，再逐渐变红，粒子体积较小时，溶液呈桔红色，而粒子体积较大时，则颜色偏向紫色。

柠檬酸钠(ml) 胶体金(nm)

5 12

4 16

3 24

2.8 30

注意：

(1)由于使用试剂质量及其它方面可能存在的误差，以及制备过程中的其它问题，胶体金粒子的大

小及一致性与理论值可能有偏差，因此，在制备完成后必须进行镜检。如出现粒子体积偏差太

大，粒子凝聚，粒子边缘不清晰等问题，须重新制备。

(2)胶体金溶液最好保存在4℃冰箱中；也可保存在室温下，一般可保存1-2个月。但决不可保存

在0℃以下，否则金粒子发生凝聚。

二、蛋白-金复合体的制备

一般认为胶体金粒子表面为一层AuCl2，因此，粒子表面带有负电荷，这种负电荷粒子之间相互排斥，形成稳定悬浮的胶体金溶液。

金颗粒表面可以包被一层生物大分子（如蛋白）来稳定和保护这些粒子，以免受外来电解质的影响而相互凝聚在一起。胶体金粒子对蛋白的吸附作用取决于pH值，这是因蛋白的净电荷取决于溶液的pH值，在pH=pI时为中性。由于在pH=pI时蛋白溶解度最小，因此这时它水化程度最小，最溶液吸附到疏水的金粒子表面。但在实际的胶体金探针制备中，一般胶体金调整为pH=PI+0.5，这样蛋白带正电，有利于结合更稳定。

胶体金探针所用蛋白必须要经过前处理，其目的在于（1）去除高浓度的盐分，高浓度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝聚，这一步往往采用低浓度缓冲液中进行。（2）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同时与多个胶体金粒子结合，影响标记的灵敏度和定量分析。（3）使蛋白具有适当的分子量。蛋白分子量过小（30 kD），形成的蛋白复合体往往是不稳定，可短时间失活。而分子量过大时，被认为影响探针的灵敏度，特别是已知蛋白的结构与活性中心的情况下，去除对活性武影响的结构部分是提高标记灵敏度，延长探针寿命（防止凝集）的有效办法。把分子量过小的蛋白与其它蛋白（如BSA，牛血清蛋白等）结合后，能制备出稳定性更佳的探针。

当蛋白前处理完成后，接着要确定胶体金与蛋白结合的最佳pH值。对于理化性质不确定的蛋白这一步尤为重要。过量的蛋白与不同pH值得胶体金结合后，只有某一特定pH 值能够形成结合最稳定的探针。在高浓度电解质（如NaCl）作用下不会凝聚。不同蛋白的适宜pH围的宽窄大不相同。一般选择最小适宜pH值为最佳pH值。但有些探针的实际情况并不完全如此，最稳定发探针并不完全代表活性最好。这要靠实验验证。

在确定最佳pH值后，最后要确定最小蛋白量，即能够形成稳定探针的蛋白的最小量。如果在制备探针时加入太多的蛋白，不仅造成浪费，而且更为严重的是容易造成探针凝聚，并严重影响标记活性。因为探针溶液中的游离蛋白容易抢先与标记位点结合，起到“封闭”（Blocking）作用，而胶体金探针标记不上。在标记位点希少、被标记物含量较少的情况