基因敲除技术最新研究进展及其应用_陶果

际操作的工作量，限制了该项技术的应用。而且，用单纯的 同源重组实现人类基因组的永久修复是不切实际的，这也严 重阻碍了生物学研究的发展［6］。
基因敲除技 术 分 为 完 全 基 因 敲 除 和 条 件 型 基 因 敲 除。 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物 个体中的靶基因活性。条件型基因敲除是指通过定位重组 系统实现特定时间和空间的基因敲除［7］。现阶段条件型基 因敲除以噬菌体的 Cre / Loxp 系统和酿酒质粒的 FLP / FＲT 系 统应用最为广泛［8］。基因敲除技术已从最初简单的完全敲 除发展到条件敲除阶段，现正朝着特定组织基因敲除、特定 时间基因敲除的可调控敲除方向发展。常见的策略有正负 双向筛选、启动子捕获、进退策略、双置换法、标记和交换法 以及重组酶介导的盒子交换法等，这些技术从不同方向发展 了基因敲除技术。
从而达到精确定点修饰的目的［20］。近 5 年来，研究者已经在 果蝇、线虫、植物、两栖类以及培养的人类干细胞中陆续报道 了利用 ZFNs 人为造成特定基因位点的 DSB，从而实现高效 率的基因定点修饰。ZFN 介导的基因敲除技术，可以精确地 修饰基因或其周围的调控元件，可为研究人类疾病构建良好 的动物模型，通过原核注射或胞质注射获得的基因敲除大 鼠、基因敲除兔［21 －22］。存在同源区的外源 DNA 时，发生同 源重组修复，能实现外源基因的定点敲入。
南昆明 650201； 2． 云南省版纳微型猪近交系重点实验室，云南昆明 650201）
（ 1． 云南农业大学动物科学技术学院，云
摘要 基因敲除技术是基因功能研究的最直接和有效的方法之一。近年来发展起来多种基因组功能性研究的高效工具，包括 ZFNs、 TALENs 和 Cas9 等，为高效率基因打靶开辟了一条全新的思路。这些基因编辑的革命性技术，能大力推动生物学、医学研究的发展。但 对这些新技术还没有进行系统研究。文中对基因敲除发展历程、技术原理以及新技术的应用等进行概述，为基因敲除技术的进一步发 展应用提供依据。 关键词 基因敲除； ＲNA 干扰； ZFNs； TALENs； Cas9 中图分类号 S 188 文献标识码 A 文章编号 0517 － 6611（ 2013） 29 － 11605 － 04
小鼠基因敲除操作技术得以较广泛的应用，这是基于完 善的胚胎干细胞系统和胚胎重建技术，由于大多数动物尚未 建立胚胎干细胞系统以及胚胎重建技术发展缓慢，大动物基 因敲除的发展受到了很大限制。目前只有通过在体细胞中 打靶并进行克隆即体细胞克隆与基因敲除技术相结合可补 弥大动物中没有 ES 细胞的缺陷、实现定点整合。但由于体 细胞扩增能力的有限和同源重组发生的几率低下，且在体外 进行长期、大量的筛选，经过长时间的培养和药物筛选，供体 细胞易衰老，染色体也可能受到损伤，所以大动物基因敲除 模型获得成功的报道并不多［9 －11］。 1． 2 利用随机插入突变进行基因敲除 大规模的随机插入 突变理论上可实现在基因组范围内敲除任一基因。这项技 术具有效率高、基因完全失活以及容易分离鉴定等优点。目 前较为有效的方法是随机插入突变可以分为 T-DNA 插入突 变和转座子插入突变，两者是在植物中使用广泛的基因敲除 手段。T-DNA 插入失活技术是利用根癌农杆菌 T-DNA 介导
基金项目 作者简介 收稿日期
国家自然科学基金项目（ 31360532 ） ； 云南省应用基础研究 计划项目（ 2013FB041） ； 云南农业大学动物科学技术学院科 研基金项目（ SW000126） 。 陶果（ 1986 － ） ，男，云南宜城人，硕士研究生，研究方向： 胚 胎生物技术，E-mail： synlelovely@ 163． com。* 通讯作者，教 授，从事遗传学研究，E-mail： zengyangzhi@ sina． com。 2013-08-18
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安徽农业科学
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转化，将一段带有报告基因的 DNA 序列标签整合到基因组 DNA 上。可以直接在植物基因组 DNA 中产生稳定的插入突 变，而且插入位点的随机性较强，但是只适用于那些容易被 T-DNA 转化的植物，且常常会引起染色体重排现象，使突变 体表型与 T-DNA 插入无关而难以进行遗传学分析。这种方 法在拟南芥中可产生 35% ～ 40% 的突变率，19% 的突变体具 有外观可察觉到的表型特征［12］。近年将 T-DNA 插入突变在 拟南芥研究中应用广泛［13］。转座子插入突变是利用转座子 在染色体上可移动的特点，当其跳跃插入到某个功能基因 时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型。植物特别 适合于转位插入突变，因为获得的基因突变可以保留在杂合 子的植株中，而通过 F1 代植株自交产生的 F2 代植株中可获 得纯合子的突变体植株。利用转座子进行基因敲除具有很 大便利，仅需已知外显子，载体构建简单，可携带多种不同抗 性基因，同时处理多基因［14］。转座子插入突变只适用于存 在内源活性转位子的植物种类，但这样的植物并不多。 2 新兴的基因敲除技术 2． 1 利用 ＲNA 干扰引起的基因敲除 ＲNA 干扰（ ＲNA interference，ＲNAi） 是 ＲNA 依赖的基因沉默现象，是双链 ＲNA （ double stranded ＲNA，dsＲNA） 分子在 mＲNA 水平上诱发的 序列特异性的转录后基因表达沉默［15］。dsＲNA 在 Dicer 酶 的作用下可产生一系列长度为 21 ～ 22 nt 的 siＲNA（ small interference ＲNA） ，siＲNA 分子、核酸酶以及螺旋酶等结合形成 ＲNA 诱 导 沉 默 复 合 物 （ ＲNA － induced silencing complex， ＲISC） ，ＲISC 以 ATP 依赖的方式催化双链 siＲNA 解旋，利用 ＲISC 内部的单链 siＲNA，通过碱基配对识别与之互补的靶 ＲNA，切割靶 ＲNA，并由 ＲNA 酶降解，从而导致目的基因的 沉默。因此，通过将 dsＲNA 分子导入细胞内，特异性地降解 细胞内与其同源的 mＲNA，封闭内源性基因的表达来失活该 基因同样可以实现基因的敲除。
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2013，41（ 29） ： 11605 － 11608，11644
责任编辑 石金友 责任校对 卢瑶
基因敲除技术最新研究进展及其应用
陶 果1，2 ，信吉阁1，2 ，肖 晶2 ，刘海京2 ，成文敏1，2 ，查星琴1，2 ，曾养志2*
图 1 ZFNΒιβλιοθήκη Baidu结构示意图片［23］
2． 3 利用 TALEN 切割特定的核苷酸靶序列引起的基因敲 除 TALENs（ Transcription Activator-like （ TAL） Effector Nucleases） 靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具， 被认为是基因敲除技术发展的里程碑。TALENs 的设计和构 建是基于植物病原体黄单胞菌（ Xanthomonas） 分泌的一种转 录 激 活 子 样 效 应 因 子 （ Transcription activator-like effector， TALE） 可以识别 DNA 序列的原理。TALE 蛋白的核酸结合 域的氨基酸序列与其靶位点的核苷酸序列有恒定的对应关 系，由 34 个氨基酸重复序列组成一个单元，重复 17 ～ 18 次， 34 个氨基酸中的第 12 和 13 个氨基酸（ Ｒepeat Variant Di － residue，ＲVD） 对应识别 1 个目标碱基。利用 TAL 的序列模 块，可组装成特异结合任意 DNA 序列的模块蛋白。TALE 蛋 白中的 DNA 结合域与 FokI 核酸内切酶的切割域融合，在特 异的位点打断目标基因，进而在该位点进行 DNA 操作，如敲 入（ Knock － in） 、敲出（ Knock － out） 或点突变［24］。
Ｒesearch Advance of Gene Knockout Technology and Its Application TAO Guo et al （ Animal Science and Technology College，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201） Abstract The gene knockout technology was deemed to be one of directly and effectively methods in gene function research． Ｒecently，several effective tools，including ZFNs，TALENs，Cas9，were developed quickly and opened the new mentality for gene targeting． These revolutionary technologies of gene editing would significantly promote the development of biology and medicine． However，reviews for the new technology are still few． In this paper，it gives a quick overview of develop history，technical principle，application for gene knockout technology，which will provide a reference for further development and application of gene knockout technology． Key words Gene knockout； ＲNAi； ZFNs； TALENs； Cas9
基因敲除技术是建立在基因同源重组技术以及胚胎干 细胞技术 的 基 础 上 而 发 展 起 来 的 一 种 分 子 生 物 学 技 术。 1987 年 Thompsson 建立了完整的 ES 细胞基因敲除的小鼠模 型［1］。2007 年度诺贝尔生理学或医学奖授予了美国科学家 Mario Ｒ． Capecchi、Oliver Smithies 和英国科学家 Martin J． Evans，以表彰他们在“涉及使用胚胎干细胞进行小鼠特定基因 修饰方 面 的 一 系 列 突 破 性 发 现”［2］。而 近 年 来 新 兴 起 了 ZFNs、TALENS、Cas9 等多种基因高效靶向修饰和调控技术。 2012 年 1 月基因组编辑核酸酶技术的《Nature Methods》杂志 评选为年度研究方法［3］，2012 年 12 月被 Science 杂志评为 2012 年度十大科学进展之一［4］。这些技术极大地提高了基 因敲除的效率，且具有极高的特异性，为研究基因功能创造 了新的途径必将极大地推动生物学、医学研究的发展，但阐 述这些新技术原理及最新进展的研究鲜有报道。因此，笔者 将就基因敲除发展历程、技术原理以及新技术的应用等进行 概述，现报道如下。 1 传统基因敲除方法 1． 1 利用同源重组进行基因敲除 基因敲除（ gene knock － out） ，又称基因打靶，是一种遗传工程技术，是在转染细胞中 发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的 DNA 同源重 组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上， 从而达到改变细胞遗传特性的目的［5］。传统的基因敲除技 术依赖于细胞内自然发生的同源染色体的随机交换，但在体 细胞内，基因同源重组的效率特别低（ 低于 10 －6 ） ，增加了实
ＲNAi 广泛存在于真菌、植物和动物中，可抑制单个基 因、基因家族和整个基因组基因表达，并且可用于试验上较 难研究的系统。ＲNAi 具有特异性强、效率高、穿透性强等特 点［16］。但 ＲNAi 不能作用于所有基因和某些细胞类型（ 如神 经元） ，但存在位置效应，临时性和不完全敲除的弊端。因 此，ＲNAi 不能完全取代传统的基因敲除技术［17］。 2． 2 锌指核酸酶基因打靶技术 锌指核酸酶基因打靶技术 （ Zinc finger nucleases，ZFNs） 的核心设计思想是将 2 个有特 定功能的结构域，即特异性识别模块和功能模块融合，形成 具有特定功能的蛋白［18］。单个 ZFN 的 DNA 结合结构域一 般包含 3 ～ 6 个 Cys2 － His2 锌指蛋白重复单位，能特异性识 别 1 个三联体碱基。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内 切酶来自 FokI 的 C 端的 96 个氨基酸残基组成的 DNA 剪切 域，每个 FokI 单体与一个锌指蛋白组相连构成一个 ZFN，识 别特定的位点，当 2 个识别位点相距 6 ～ 8 bp 距离时，2 个单 体 ZFN 相互作用产生酶切功能［19］。在此特异位点产生 1 个 DNA 双链切口（ Double strands breaks，DSB） ，然后利用细胞 固有的同源重组或非同源末端连接修复机制进行切口修复，