最新8 超薄切片与半薄切片汇总

8超薄切片与半薄切

片

第8讲半薄/超薄切片技术

取材→固定→脱水→渗透→包埋→聚合→修块→切片→染色

现有的透射电镜生物制品制备技术分为两类：

一类是透射电镜的基本制备技术，包括超薄切片和负染色法；

另一类是生物制品特殊技术，包括冷冻蚀刻法、冰冻割断术、电镜细胞化学术、免疫电镜术、电镜放射自显影技术、X线微区分析技术等。

基本概念

一、生物样品制备技术的重要性

1、决定电镜图像分辨率的两个因素

1）电镜本身的分辨本领

2）样品的结构和反差，而样品的结构与反差在很大程度取决于样品制备技术

2、电镜样品应具备的基本条件

1）样品必须彻底干燥；

2）样品要进行提高反差处理

2）样品要进行提高反差处理

4）样品耐受电子束的轰击

5）充分保存好生物样品的超微结构

二、TEM样品制备技术分类

1、超薄切片技术（普通）

2、冷冻超薄切片技术

3、冷冻置换和低温包埋技术

4、金属投影技术

5、表面复型技术

6、冷冻(断裂)蚀刻及复型技术

7、免疫电镜技术

8、电镜细胞化学技术 7、8、9是TEM，SEM共有

9、电镜放射自显影技术

三、超薄切片技术概述

1、超薄切片

★样品厚度在10～100nm之间的切片，超薄切片TEM专用

石蜡切片h=10μm(5~50μm)

2、制作超薄切片的必要性

1) 增加电子透射能力

2) 电镜的场深大，切片太厚，上下结构重

叠,使得图像不清楚

3) 减少色差

4) 减少样品对电子的吸收

3、对超薄切片的要求

⑴细胞的细微结构保存良好，没有明显的物质凝聚、丢失、添加等人工效应

⑵切片厚度500～700Å为宜 ,小于1000 Å

太薄：δ高，反差低

太厚：δ低，反差好，结构重叠，电子甚至

不能穿透

⑶切片应耐电子束的强烈照射，不变形，升华

⑷切片能够适当被染色，保证一定的反差

⑸切片均匀，无皱褶、刀痕，无染色剂或其他

化学物质的沉淀

普通超薄切片技术：

一、取材二、固定三、脱水四、渗透与包埋五、超薄切片六、电子染色

一、取材

1、含义：指从生物体上取下要观察的组织块。

注意：由于水解酶的作用可引起细胞自溶

2、取材操作规则:快,小, 冷,准,稳,轻(防损伤)

⑴快：动作迅速,快取,投入固定液

⑵小：样品体积小,动1mm3,植宽1，长3～4mm

⑶冷：0～4℃

⑷准：取的部位准，有代表性、目的性

⑸轻：操作轻巧，避免拉、锯、压

A、按样品类别分为：

⑴动物材料

麻醉→解剖→戊二醛预固定（ 0～4℃， 2％～5％）

在预冷的玻板上细切（1mm3）→戊二醛前固定

(1～3h) →漂洗（10～30min）→ 1％锇酸后固定

(1～2h)

⑵植物材料

叶片宽1，长3～4，有时需脱蜡

根茎果实1mm3

⑶单细胞：洗去有机成分→固定→预包埋→切块

B、按取材地点分为：

⑴野外取材：冰壶

⑵实验室室内取材

1.2 取材方法

材料放在洁净的韧性较大的纸上→滴上预冷的固定液→用刀片将组织切下并修小→用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷的固定液的小瓶中。

植物材料的取材可以先切成薄片，经适当固定后再切成小方块继续固定。

二、固定

（一）固定的基本知识

1、概念：用化学或物理方法迅速将细胞、组织杀死,同时把从细胞间的联系到细胞器的分子结构等全部组织的活体形态、精细结构及其组成真实的保存下来.

2、常用的固定方法

⏹化学方法：锇酸（OsO4), 戊二醛（C5H8O2),甲醛(HCHO)，高锰酸钾KMnO4、重铬酸钾、丙烯醛

⏹物理方法：冷冻，干燥，高温

3、固定的目的

⑴把细胞中的动态系统定格，要求生命过程立即停止,细胞和它周围组织中的半液体内含物立即凝固而不分解,接近细胞有机体的生活状态

⑵防止以后的制备过程中丢失或添加成分

⑶使其在电镜下有良好的电子反差

4、固定的标准

细胞内膜结构线条清晰连续不断，细胞基质无明显溶泡和颗粒凝集

5、固定液的作用：

1）组成：

固定液：固定剂＋缓冲液

2）作用：

⑴破坏细胞的酶活性系统

⑵稳定细胞物质成分，并保存之

⑶接近细胞生活状态的渗透压,使细胞不收缩或膨胀

⑷在组分的分子之间建立交联，提供骨架稳定细胞器的空间构型

⑸提供一定的电子反差

（二）常用的固定剂

1、常用、理想固定剂应具备的条件

1）渗透力强，穿透速度快，能迅速达到组织块的各部位，立即杀死细胞，以尽量减小死后变化

2）稳定细胞成分和结构，使各种结构成分凝固或变性，以保证后续的各种处理中物质不溶解、不丢失

3）使细胞不变形，保持各种结构生活时形状，不产生人工假象，以保证电镜图像的真实性。

4) 能保存一定的酶活性,以供细胞化学的测定

5) 最好提供一定的反差 ,并有防腐作用

2、理想固定剂

1）锇酸（OsO4)

优点：

⑴几乎和细胞内所有成分发生化学结合

⑵对氮具有较强亲和力，对含有蛋白质的细胞结构固定作用良好

⑶可保存脂肪,形成脂肪-锇复合物

⑷ Z=76，增加膜的反差

⑸对磷脂蛋白、核蛋白保护很好

锇酸缺点：

⑴不能固定糖元、碳水化合物、核酸，对微管固定效果差

⑵酶的钝化剂，不能用于细胞化学研究

⑶分子量大,渗透能力差，要求组织块小

⑷固定时间不宜过长

⑸可与乙醇、醛类氧化还原反应生成沉积

⑹有挥发性、剧毒

2）戊二醛（ C5H8O2）

优点：

⑴固定迅速，样品块可以大于1mm3

⑵能保存糖元、蛋白质、核蛋白，核酸，尤其对微

管，内质网等固定效果最好，对细胞内结构有较

强的亲和力

⑶可长时间固定（<7天），适于野外取材

⑷不易使酶失活，适于细胞化学研究

⑸不挥发，但容易经皮肤吸收，对呼吸道粘膜有

刺激性

缺点：

⑴不保存脂肪

⑵无电子染色作用

⑶对缓冲液的要求严格

双固定法：指用戊二醛对样品前固定，漂洗后使用锇酸对样品进行后固定，这种使用两种化学试剂分别前后对样品进行固定的方法称为双固定法。