育种学的论文

山东农业大学

育种学课程论文题目：分子标记技术在作物育种中的应用

学院：农学院

专业班级：农学二班

学生姓名：李辰

学号：20132766

指导教师：郭营

分子标记技术在作物育种中的应用

李辰

（山东农业大学，农学院，20132766）

摘要:介绍了几种分子标记技术的基本原理和特点, 总结了分子标记技术在植物亲缘关系和遗传多态性研究、DNA 指纹库的建立、遗传图谱的构建及分子标记辅助选择育种等方面的应用, 并对分子标记技术在植物遗传育种领域的应用前景进行了展望。

关键词:分子标记技术;遗传育种;应用

Application of molecular marker technol ogy in crop

breeding

Lichen

(Shandong Agricultural University Agriculture Institution Tai an 271000) Abstract: introduced the principles and characteristics of several kinds of molecular mark ers technology, summarized the application of molecular marker technique in plant genetic relationship and genetic polymorphism study, DNA fingerprint database establishment, gen etic map construction and molecular marker assisted selection breeding, application prospec t and bisection labeling technique in the field of plant genetics and breeding were discuss ed.

Key words: molecular marker technology; genetic breeding; application

0前言

DNA 分子标记技术产生于20 世纪70 年代, 是一种理想的遗传标记技术, 与传统的遗传标记相比,具有诸多优点: (1)不受组织类别、发育阶段等限制; (2)不受环境影响; (3)标记数量多; (4)多态性高;(5)许多标记表现为共显性; (6)简单、快速、易于自动化。目前分子标记主要用于分类学及遗传多样性分析、遗传图谱的构建、目标基因的标记与定位、品种纯度及亲缘关系的鉴定、杂种优势及产量的预测和分子标记辅助选择(Marker-assisted selection, MAS)育种等方面。

1分子标记技术的原理和特点

1.1 限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)

1980 年Bostein 等[ 4] 首先提出了利用RFLP 标记构建遗传连锁图, 而美国冷泉港实室正是利用此技术成功确定了腺病毒血清型突变体的遗传连锁图。RFLP 基本原理是利用特定的限制性内切酶(restrictionenzyme , RE)识别并切割不同生物个体的基因组DNA , 得到大小不等的DNA 片段, 所产生的DNA 片段数目和各片段的长度反映了DNA 分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段, 就形成不同的带, 再与克隆DNA 探针进行Southern 杂交和放射显影, 即可获得反映特异性的RFLP 图谱。RFLP 所表现的是基因组DN

A 在限制性内切酶消化后产生片段在长度上的差异, 主要是由于不同个体基因组DNA序列上的变化, 如碱基替换或缺失造成限制性内切酶酶切位点的增加或丧失以及内切酶酶切位点间DNA片段的插入、缺失或重复等。但RFLP 技术存在的缺陷, 如在克隆可表现基因组DNA 多态性的探针时较为困难, 阻碍着其更广泛的应用。

1.2染色体原位杂交(Chromosome in situ hybridization)

是一种基于Southern 杂交的分子标记技术。它利用特异性核酸片段作探针, 直接同染色体DNA 片段杂交, 在染色体上显示特异DNA。可采用同位素标记探针, 杂交后通过放射自显影显示杂交信号, 也可以采用非放射性大分子如生物素、地高辛等标记特异核酸片段, 杂交信号经酶联显色或荧光显色得以显示。原位杂交的优点是准确、直观, 但技术非常复杂。

1.3 PCR(Polymerase Chain Reaction)

即聚合酶链式反应。此项技术是模仿DNA 在生物体内的自然复制过程, 来扩增DNA 片段。PCR 的模板是DNA, 依据被扩增区域两侧边界DNA 序列人工合成一对引物(通常为20 个碱基的单链脱氧核苷酸小片段), 每种引物分别与对应的一条DNA 链互补, 在DNA 聚合酶的作用下扩增DNA 片段。PCR 反应一般经三步完成一个循环:1.高温变性, 使DNA 双链解开, 2.低温退火, 让引物与单链模板互补结合, 3.中温延伸, 以互补的引物为复制起点, dNPTS 为原料, 进行复制。这样一次循环, DNA 就扩增一倍。经25 -30 次循环后, DNA 的量就达到足以检测的水平(ng 级)。PCR的优点是不需要同位素, 安全性好, 便宜, 快速易行, 易于自动化。目前大多数分子标记技术都是建立在PCR 技术的基础之上的。

1.4 随机扩增多态性DNA(Randomly Amplified Polymorphism DNA,RAPD)

该技术是由Williams 等[ 6] 以PCR 为基础发展起来的一种新型分子遗传标记技术。它是利用随机排列的寡聚脱氧核酸单链引物(一般为8 ～ 10bp), 通过PCR 非定点地扩增染色体组中的DNA 所获得的长度不同的多态性DNA 片段。RAPD 所使用的引物各不相同, 但对任一特定引物它在基因组DNA 序列上具有其特定的结合位点, 一旦基因组在这些区域发生DNA 片段插入、缺失或碱基突变, 就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化, 从而引起扩增产物数量和长度发生改变, 表现出多态性。与RAPD 标记类似的还有任意引物PCR(Arbitr arily Primed PCR,AP-PCR)标记和DNA 扩增指纹(DNA Amplification Finger-printing ,D AF)。

1.5 扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)

该标记技术是由Zebeau 和Vos 等[ 7] 发展的一种新的DNA 标记技术。AFLP 实际上是R FLP 与PCR 相结合的产物, 其基本原理是将基因组DNA 进行限制性内切酶酶切, 然后选择特定的片段进行PCR 扩增, 通常使用双链人工“接头”与“接头”相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合位点。AFLP 标记所用的专用引物由三部分组成:与人工接头互补的核心碱基序列;限制性内切酶识别序列;引物3′端的选择碱基序列(1 ～10bp)。因此只有那些两端序列能与碱基配对的限制性酶切片段被扩增, 扩增片段经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测[ 8] 。该技术的优点是在不事先知道DNA 序列信息的前提下, 可以对酶切片段进行经典PCR 扩增。选择碱基包括1～ 10 个数量不等的随机核苷酸序列可以调节AFLP 产物的条带特异性和数量, 提供较多的基因组多态性信息, 同时也克服了RAPD 重复性差的问题。在实验过程中一般采用两个限制性内切酶(一个酶为多切点, 另一个酶的切点较少),因此AFLP 分析中产生的主要是由两个酶共同酶切的片段。

1.6 简单序列重复(Simple Sequence Repeat ,SSR)

在真核生物基因组中均存在着由1 ～ 5 个碱基对组成的简单重复序列, 又称之为微卫星(microsatellite), 如(GA)n 、(GCC)n 等。同一类微卫星DNA 可分布于整个基因组不同位置上, 其高度多态性主要来源于重复次数的不同或重复程度的不完全性。SSR 是指在生物基因组中存在一个或几个碱基可变次数的串联重复序列(Short tandem repeat, STR)。对