色谱分离方法
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有机色谱分离技术
有机色谱别离技术色谱法又称层析法。
它是有机化合物别离、分析的重要方法之一。
既可用于别离复杂的混合物，又可以用来定性鉴定，尤其适用于少量物质的别离和鉴定。
这种技术不仅用于石油、化学化工等部门，而且在药物分析、中草药有效成分的别离分析、药物体内代谢研究、毒物分析及环境保护等方面也是必不可少的工具。
色谱法与溶剂萃取法相似，也是以相分配原理为根据。
利用混合物中各组分在某一物质中的吸附、溶解性能的不同或其它亲和作用性能的差异，在混合物的溶液流经该种物质时，通过反复的吸附或分配作用，将各组分分开。
流动的混合物溶液称为流动相；固定的物质称为固定相。
假如化合物和固定相的作用较弱，那它将在流动相的冲洗下较快地从层析体系中流出来；反之化合物和固定相的作用较强，它将较慢地从层析体系中流出来。
根据操作条件的不同，色谱法可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相色谱等类型。
有机化学实验常用的有薄层色谱、柱色谱和纸色谱。
应用色谱法的目的有两个，一是用于分析，二是用于制备别离。
根据实验目的的不同，实际操作中要把握好速度、别离度与分析样品量的关系，假如想得到比拟纯的样品，那么上样量就不必太多，样品量少有利于各组分的别离。
色谱法别离混合物时各组分在固定相外表存在不同的吸附与脱附的平衡，一个分子的吸附性能与极性有关，也与吸附剂的活性及流动相的极性有关。
化合物的极性很大程度依赖于官能团的极性强弱，因此不同类型的化合物往往表现出不同的吸附才能，常见官能团的极性顺序如下：饱和烃<烯烃<芳烃、卤代烃<硫化物<醚类硝基化合物<醛、酮、酯<醇、胺<亚胺<酰胺<羧酸当然这一顺序只是经历值，比拟粗略，对于复杂化合物的极性只能通过实验比拟。
在层析中选用何种吸附剂要视被别离的化合物性质而定。
理想的吸附剂应该具备以下条件：可以可逆地吸附待层析的物质；不能使被吸附物质发生化学变化；粒度大小应使展开剂以均匀的流速通过。
第七章 色谱分离技术
固定相和流动相、操作条件。
④ 设备简单，操作方便，且不含强烈的操作条件， 因而不容易使物质变性，特别适于不稳定的大分子 有机化合物。
缺点： 处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此 主要用于实验室，工业生产上应用较少。
3.色谱法的分类 吸附色谱法
分配色谱法
分离机理
离子交换色谱法 凝胶色谱法
亲和色谱法
（一）基本原理
溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表 面时，分子会贴在固体表面上，发生吸附作用。
1.发生吸附作用的原理：
固体表面分子（或原子）与固体内部分子（或原子） 所处的状态不同：
固体内部分子（或原子）受临近四周分子的作用力是 对称的，作用力总和为零，即彼此互相抵消，故分子处 于平衡状态。
界面上的分子所受的力不对称，作用力总和不等于零， 合力指向固体内部。
小分子
（二）凝胶过滤介质
基本要求：
不能与原料组分发生除排阻之外的任何其他相 互作用，如电荷作用、化学作用、生物学作用
高物理强度、高化学稳定性 耐高温高压、耐强酸强碱 高化学惰性 内孔径分布范围窄 颗粒大小均一度高
常用的凝胶过滤介质 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
1. 葡聚糖凝胶
pH、缓冲液浓度、离子强度
③ 柱操作 柱的大小、长短 ④ 流速的控制 高速度、高效率 ⑤ 清洗 除去不结合的所有物质 ⑥ 洗脱 特异性洗脱（竞争性置换目的物） ⑦ 柱的再非生特异性洗脱（调节pH、离子强度和种类、温度）
（五）亲和色谱法的应用
1.亲和色谱法的特点： 专一、高效、简便、快速
2.应用 ① 分离和纯化各种生物分子 纯化生物大分子，适于从组织或发酵液中分离
色谱法应运而生。
色谱分离是一组相关技术的总称，又叫做色 谱法、层析法，是一种高效而有用的生物分离 技术。
④ 设备简单，操作方便，且不含强烈的操作条件， 因而不容易使物质变性，特别适于不稳定的大分子 有机化合物。
缺点： 处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此 主要用于实验室，工业生产上应用较少。
3.色谱法的分类 吸附色谱法
分配色谱法
分离机理
离子交换色谱法 凝胶色谱法
亲和色谱法
（一）基本原理
溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表 面时，分子会贴在固体表面上，发生吸附作用。
1.发生吸附作用的原理：
固体表面分子（或原子）与固体内部分子（或原子） 所处的状态不同：
固体内部分子（或原子）受临近四周分子的作用力是 对称的，作用力总和为零，即彼此互相抵消，故分子处 于平衡状态。
界面上的分子所受的力不对称，作用力总和不等于零， 合力指向固体内部。
小分子
（二）凝胶过滤介质
基本要求：
不能与原料组分发生除排阻之外的任何其他相 互作用，如电荷作用、化学作用、生物学作用
高物理强度、高化学稳定性 耐高温高压、耐强酸强碱 高化学惰性 内孔径分布范围窄 颗粒大小均一度高
常用的凝胶过滤介质 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
1. 葡聚糖凝胶
pH、缓冲液浓度、离子强度
③ 柱操作 柱的大小、长短 ④ 流速的控制 高速度、高效率 ⑤ 清洗 除去不结合的所有物质 ⑥ 洗脱 特异性洗脱（竞争性置换目的物） ⑦ 柱的再非生特异性洗脱（调节pH、离子强度和种类、温度）
（五）亲和色谱法的应用
1.亲和色谱法的特点： 专一、高效、简便、快速
2.应用 ① 分离和纯化各种生物分子 纯化生物大分子，适于从组织或发酵液中分离
色谱法应运而生。
色谱分离是一组相关技术的总称，又叫做色 谱法、层析法，是一种高效而有用的生物分离 技术。
色谱分离技术
二、离子交换树脂的性能 1. 交联度（degree of cross linking）： 离子交换 交联度（ ）： 树脂上胶联剂的含量称为交联度。 树脂上胶联剂的含量称为交联度。交联度用重量百分 比表示， 标号树脂， 比表示，如“×4”标号树脂，其交联度为 标号树脂 其交联度为4%。应根据 。 试样性质进行选择。 试样性质进行选择。 2.交换容量：每千克干树脂能参加交换反应的活 交换容量： 交换容量 性基团数， 表示。 性基团数，用mmol/g or mmol/ml表示。 表示 粒度：离子交换树脂颗粒的大小， 粒度：离子交换树脂颗粒的大小，用树脂溶胀态 所能通过的筛孔数表示。 所能通过的筛孔数表示。 三、流动相 离子交换色谱流动相最常用的是水缓冲液。 离子交换色谱流动相最常用的是水缓冲液。有酸 性缓冲溶液和碱性缓冲液，有时也用有机溶剂（甲醇、 性缓冲溶液和碱性缓冲液，有时也用有机溶剂（甲醇、 乙醇）同水缓冲液混合使用。流动相的pH， 乙醇）同水缓冲液混合使用。流动相的 ，缓冲液的 类型，离子强度， 类型，离子强度，以及加入的有机溶剂都会影响组分 的分离。 的分离。
二、纸色谱法 （一）基本原理 纸色谱法是用滤纸作载体的平面色谱法。 纸色谱法是用滤纸作载体的平面色谱法 。 固定相 为纸纤维吸附的水或吸留的甲醇胺、缓冲液等。 为纸纤维吸附的水或吸留的甲醇胺 、 缓冲液等 。 流动 相为与水不相混溶的有机溶剂。 相为与水不相混溶的有机溶剂 。 因为吸附在纤维上 20%的水分中，有约 的水分中， 的水分中 有约6%可通过氢键与纸纤维素上的羟 可通过氢键与纸纤维素上的羟 基结合生成复合物，与亲水性溶剂可形成两相。 基结合生成复合物 ， 与亲水性溶剂可形成两相 。 纸色 谱法属分配色谱， 谱法属分配色谱 ， 是利用样品组分在两相间分配系数 的不同达到分离的目的。实际上，纸色谱的分离机制 的不同达到分离的目的。 实际上， 较复杂，除分配外， 较复杂 ， 除分配外 ， 可能还有溶质与纸纤维素间的吸 附作用，与纸纤维素上某些基团（ 附作用 ， 与纸纤维素上某些基团 （ 造纸时引入到纤维 素上的）之间的离子交换作用。 素上的）之间的离子交换作用。
天然药物化学第二章,第三节,色谱分离
薄层色谱的操作技术流程
铺
板
点
样
展
开
计算比移值
显色与定位
二、吸附色谱法
（五）操作技术 1.薄层色谱法 步骤：制板→点样→展开→显色→Rf值计算
43
操作步骤
（1）软板的制备
软板：直接将吸附剂(我们有哪些吸咐剂）铺在玻璃板上制 成，不加粘合剂 要求：厚度→随分离要求而定，一般0.25～0.5mm 玻璃棒推动速度不宜过快、也不应停顿→影响厚度均一性
5
植物色素分离图示
一、分离原理和基本概念：
色谱法： 是利用混合物中各成分在 流动相和固定相之间的 作用力和亲和力（吸附， 分配，离子交换、分子 筛）的不同，在两相中 作相对移动时，混合物 中各种成分随流动相运 动速度不同，从而达到 相互分离的方法。
7
8
色谱分离
慢 中等 快
淋洗液
Temporal course
适用范围
酸性成分：氨基酸、有机酸； 对酸稳定的中性成分 生物碱、甾体、强心苷
备注
不适用：醛、 酮、酯、内酯 类成分
中性成分：醛、酮、皂苷、萜 中性 6.5~7.5 类
★
27
常用吸附剂
2.硅胶（应用最多★） 吸附能力决定于硅羟基数，吸附活性取决于含水量。
OH Si O O Si O O O O O OH Si O Si O O Si O O O OH Si O Si O O Si O O O OH Si O Si O O O OH Si O Si O O O
炭。
二、吸附色谱法
（二）吸附剂（固定相） 选择合适的吸附剂是吸附色谱法成功的关键。★ 良好的吸附剂应具备： ①不与样品及流动相发生化学反应 ②不溶于流动相 ③具有较大的表面积和一定的吸附能力。 ④具有一定的细度，颗粒要均匀。
中药化学2.2 色谱分离技术
CH2 N O C CH2 CH2 CH2 H N C CH2 O H N CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 H O C CH2 N CH2 CH2 C O H O H H3C O H3C CH3 CH3 O
聚酰胺吸附力的影响因素： 1:形成氢键的能力与溶剂有关 水中＞有机溶剂中＞碱性溶剂中 常用溶剂对聚酰胺洗脱能力顺序如下： 水＜甲醇或乙醇＜丙酮＜稀氢氧化钠液或稀氨溶 液＜甲酰胺或二甲基甲酰胺＜尿素水溶液。
注意温度超过150 ℃则游离硅醇基之间脱 水形成硅氧醚结构丧失游离硅醇基的吸附能力。 为酸性吸附剂适于分离中性或酸性成分。
常用硅胶：
硅胶H（不含黏合剂） 硅胶G（含黏合剂） 硅胶GF254(含煅石膏，另含有一种无机荧 光剂)。硅胶GF254nm紫外光下呈强烈黄绿色 荧光背景，在荧光背景下通过紫外光照射成分 斑点为暗斑，常用于一般显色手段不易显色的 成分的分离。
3、 洗脱：
洗脱操作的目的是要将加入的样品中各个 组分先后从上往下带出来，并能分开收集各成 分。 洗脱的过程中，上端溶剂不能干，分段收 集是关键；作定性检查合并相同成分。 TLC时Rf为0.2－0.3的溶剂系统是最佳的 洗脱系统，梯度洗脱。
4. 应用 柱色谱分离能力比薄层分离能力更强， 效果更好，尤其对结构相似、性质接近、 采用薄层难以分离的成分分离效果好。
（一）吸附剂
4、常用的吸附剂
（1）硅胶SiO2•xH2O 多孔性的硅氧烷交链结构，极性吸附剂， 吸附性较氧化铝稍低，既适于分离亲水性成分， 又可用于分离亲脂性成分。 其吸附作用的强弱取决于游离硅醇基的数 目，也与含水量有关，含水量达17％以上，则 失去吸附性，所以需110℃活化30分钟。
（一）吸附剂
例：求图中A、B、C三斑点Rf大小并判断三成分 极性大小顺序。
聚酰胺吸附力的影响因素： 1:形成氢键的能力与溶剂有关 水中＞有机溶剂中＞碱性溶剂中 常用溶剂对聚酰胺洗脱能力顺序如下： 水＜甲醇或乙醇＜丙酮＜稀氢氧化钠液或稀氨溶 液＜甲酰胺或二甲基甲酰胺＜尿素水溶液。
注意温度超过150 ℃则游离硅醇基之间脱 水形成硅氧醚结构丧失游离硅醇基的吸附能力。 为酸性吸附剂适于分离中性或酸性成分。
常用硅胶：
硅胶H（不含黏合剂） 硅胶G（含黏合剂） 硅胶GF254(含煅石膏，另含有一种无机荧 光剂)。硅胶GF254nm紫外光下呈强烈黄绿色 荧光背景，在荧光背景下通过紫外光照射成分 斑点为暗斑，常用于一般显色手段不易显色的 成分的分离。
3、 洗脱：
洗脱操作的目的是要将加入的样品中各个 组分先后从上往下带出来，并能分开收集各成 分。 洗脱的过程中，上端溶剂不能干，分段收 集是关键；作定性检查合并相同成分。 TLC时Rf为0.2－0.3的溶剂系统是最佳的 洗脱系统，梯度洗脱。
4. 应用 柱色谱分离能力比薄层分离能力更强， 效果更好，尤其对结构相似、性质接近、 采用薄层难以分离的成分分离效果好。
（一）吸附剂
4、常用的吸附剂
（1）硅胶SiO2•xH2O 多孔性的硅氧烷交链结构，极性吸附剂， 吸附性较氧化铝稍低，既适于分离亲水性成分， 又可用于分离亲脂性成分。 其吸附作用的强弱取决于游离硅醇基的数 目，也与含水量有关，含水量达17％以上，则 失去吸附性，所以需110℃活化30分钟。
（一）吸附剂
例：求图中A、B、C三斑点Rf大小并判断三成分 极性大小顺序。
色谱分离法
应用：分离半胱氨酸、分离含半胱氨酸（-SH)的肽段、分
离含-SH基的蛋白质或进一步分离该蛋白质中-SH基附近的 肽段。
16.3.5 聚焦色层分离法(Focusing chromatography)
基于离子交换的原理，根据两性电解质分子 间等电点的差别进行分离纯化的洗脱层析法。
当向层析柱内通入与柱内初始pH值不同的多缓 冲剂时，柱内pH值缓慢改变，在轴向形成连续的 pH梯度，使料液中的溶质依据各自的等电点或者 吸附或者脱附逐次向下移动，彼此之间得到分离。
16.2.5色谱分离的有关术语
死体积
保留时间（tR）和溶出体积（VR） 反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的 基本热力学参数之一。
16.2.5色谱分离的有关术语
④色谱柱的理论塔板数、塔板高度 Martin和Syng最早提出塔板理论，将色谱柱比作蒸馏塔， 把一根连续的色谱柱设想成由许多小段组成。在每一小段 内，一部分空间为固定相占据，另一部分空间充满流动相 。组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。并 假定在每一小段内组分可以很快地在两相中达到分配平衡 ，这样一个小段称作一个理论塔板，一个理论塔板的长度 称为理论塔板高度H。经过多次分配平衡，分配系数小的 组分，先离开蒸馏塔，分配系数大的组分后离开蒸馏塔。 由于色谱柱内的塔板数相当多，因此即使组分分配系数只 有微小差异，仍然可以获得好的分离效果。
16.3.3金属螯合层析
金属螯合层析技术在现代基因工程中常用 于表达蛋白的分离
NH2
Ni
NH2
His
His His
His
protein
▁▁▁▂▃▄▅▆▇▇▆▅▄▃▂▁▁▁▁▂▃▄▅▆▇▇▆▅▄▃▂▁
16.3.3金属螯合层析
利用 IMAC 分离纯化生物大分子
离含-SH基的蛋白质或进一步分离该蛋白质中-SH基附近的 肽段。
16.3.5 聚焦色层分离法(Focusing chromatography)
基于离子交换的原理，根据两性电解质分子 间等电点的差别进行分离纯化的洗脱层析法。
当向层析柱内通入与柱内初始pH值不同的多缓 冲剂时，柱内pH值缓慢改变，在轴向形成连续的 pH梯度，使料液中的溶质依据各自的等电点或者 吸附或者脱附逐次向下移动，彼此之间得到分离。
16.2.5色谱分离的有关术语
死体积
保留时间（tR）和溶出体积（VR） 反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的 基本热力学参数之一。
16.2.5色谱分离的有关术语
④色谱柱的理论塔板数、塔板高度 Martin和Syng最早提出塔板理论，将色谱柱比作蒸馏塔， 把一根连续的色谱柱设想成由许多小段组成。在每一小段 内，一部分空间为固定相占据，另一部分空间充满流动相 。组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。并 假定在每一小段内组分可以很快地在两相中达到分配平衡 ，这样一个小段称作一个理论塔板，一个理论塔板的长度 称为理论塔板高度H。经过多次分配平衡，分配系数小的 组分，先离开蒸馏塔，分配系数大的组分后离开蒸馏塔。 由于色谱柱内的塔板数相当多，因此即使组分分配系数只 有微小差异，仍然可以获得好的分离效果。
16.3.3金属螯合层析
金属螯合层析技术在现代基因工程中常用 于表达蛋白的分离
NH2
Ni
NH2
His
His His
His
protein
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16.3.3金属螯合层析
利用 IMAC 分离纯化生物大分子
色谱分离的技术
是所有分离纯化技术中最高的(不计电泳)。 若用理论塔板数来表示柱效率，每米柱长可达103～105块塔板。 通常色谱柱长一般只有几厘米至几十厘米。 从极性到非极性、离子型到非离子型、小分 子到大分子、无机到有机及生物活性物质，以及热稳定到热不稳 定的化合物，都可用色谱法分离。 色谱分离有很强的选择性, 可通过多种途径 选择不同的操作参数，以适应各种不同样品的分离要求。
7.1.2.2 按固定相形状不同分类
(1)柱色谱
进样量大，回收容易。 除用于分析外，还广泛用于生物样品 的制备和工业生物产品的分离与纯化。
(2)纸上色谱 广泛用于定性与定量分析，不用于制备和生产。
(3)薄层色谱
主要用于分析，也可用于小量样品的制备。
7.1.2.3 其他分类方法
(1) 根据流动相的物态分类 气相色谱 、液相色谱和超临界色谱
Ve Vo K d Vi
或
(7-29) (7-30)
Ve Vo Kd Vi
Kd＝1，溶质分子完全不被排阻， 可自由进入所有凝胶颗粒微孔。 Kd＝0，溶质分子完全被排阻于凝胶颗粒微孔之外，最先被洗脱。 对于中等分子，能进入部分凝胶空间，0＜Kd＜1。 当具有不同分子量物质的混合液流经凝胶柱时，其Kd值的大小就 决定了物质的流出顺序，即Kd值小的先流出，Kd值大的后流出。
7.1.4.2 吸附色谱
吸附色谱分离就是根据吸附剂(固定相)对不同物质的吸 附力不同而使混合物分离的。
离子交换色谱和亲和色谱也可归类于吸附色谱，前者主要 是静电引力的作用，而后者是生物专一亲和力的作用。
在一定温度下，分离物质在液相和固相中的浓度关系可用吸附 方程式来表示：
Ka A B A B Kd
极高的分辨率;
1944年 出现纸层析;
7.1.2.2 按固定相形状不同分类
(1)柱色谱
进样量大，回收容易。 除用于分析外，还广泛用于生物样品 的制备和工业生物产品的分离与纯化。
(2)纸上色谱 广泛用于定性与定量分析，不用于制备和生产。
(3)薄层色谱
主要用于分析，也可用于小量样品的制备。
7.1.2.3 其他分类方法
(1) 根据流动相的物态分类 气相色谱 、液相色谱和超临界色谱
Ve Vo K d Vi
或
(7-29) (7-30)
Ve Vo Kd Vi
Kd＝1，溶质分子完全不被排阻， 可自由进入所有凝胶颗粒微孔。 Kd＝0，溶质分子完全被排阻于凝胶颗粒微孔之外，最先被洗脱。 对于中等分子，能进入部分凝胶空间，0＜Kd＜1。 当具有不同分子量物质的混合液流经凝胶柱时，其Kd值的大小就 决定了物质的流出顺序，即Kd值小的先流出，Kd值大的后流出。
7.1.4.2 吸附色谱
吸附色谱分离就是根据吸附剂(固定相)对不同物质的吸 附力不同而使混合物分离的。
离子交换色谱和亲和色谱也可归类于吸附色谱，前者主要 是静电引力的作用，而后者是生物专一亲和力的作用。
在一定温度下，分离物质在液相和固相中的浓度关系可用吸附 方程式来表示：
Ka A B A B Kd
极高的分辨率;
1944年 出现纸层析;
色谱分离
高效液相色谱仪
高效液相色谱(HPLC)流程示意图
离子交换色谱
• 离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团， 这些带 电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果 流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律， 这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。固定相 基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子 交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可 用来与流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫 做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2， 及－MH3+ ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－ COOH。其中-NH3+离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于 强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换 能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只 有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交 换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动 分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、 核苷和各种碱基的分离等。
色谱法的发展历程
◆ 1903年 Tswett创立色谱法（在碳酸钙上分离了叶绿素）。 由Tswett创立的色谱法分离效率低，分离时间长，根据样品的不同， 一般分离需要几小时至几天。 ◆20世纪40年代至50年代初，先后出现了纸色谱（paper chromatography,PC）和薄膜色谱法(thin-layer chromatography,TLC)。 特点：较经典色谱法简单、分离时间短，样品量要求小。 ◆1952年，James和Martin提出了气相色谱法（gas chromatography,GC) 特点： 以气体作为流动相。应用范围广泛受到人们重视。但对不 易气化和热不稳定性差的化合物难以分离。 ◆ 20世纪60年代后期由于新型色谱柱填料的，高压输液泵和高灵 敏度的监测器的出现，发展出了高效液相色谱（High performance liquid chromatograghy,HPLC）。
色谱分离方法
色谱分离方法是一种常用的分析技术，用于将混合物中的化学物质按照其在固定相和流动相之间相互作用的差异进行分离。
常见的色谱分离方法包括气相色谱（Gas Chromatography, GC）、液相色谱（Liquid Chromatography, LC）以及超高效液相色谱（Ultra-High Performance Liquid Chromatography, UHPLC）等。
气相色谱（GC）是利用气体载气将样品中的化合物分离的方法。
在气相色谱中，样品被蒸发成气体并通过柱子上的固定相。
不同化合物在固定相上的停留时间不同，从而实现分离。
液相色谱（LC）则是基于液相为流动相的分离技术。
在液相色谱中，样品溶解在溶剂中，通过柱子上的固定相进行分离。
根据样品与固定相之间的相互作用力的不同，达到化合物分离的目的。
超高效液相色谱（UHPLC）是近些年发展起来的一种液相色谱技术。
它采用高压泵将流动相压入毛细管柱中，通过小颗粒固定相实现高效分离。
此外，还有其他的色谱分离方法，如离子色谱（Ion Chromatography, IC）、凝胶色谱（Gel Chromatography）等，它们根据需要选择不同的分析方法进行分离与检测。
天然药物化学(中药化学)中药化学第二章2(3)色谱分离技术
浓缩
柱层析操作（跑柱子）
二）、薄层色谱
粒径 5~40 m
1．吸附剂
硅胶
硅胶H 硅胶G 硅胶GF254 硅胶HF254
常用
氧化铝 硅藻土
聚酰胺
微晶纤维素
想一想 H、G、F各代表何种意思？试解释硅胶HF365？
种类
玻璃板 塑料膜
厚度 2mm
规格
5cm×20cm 10cm×10cm 10cm×15cm
紫外分析仪(三用)
6．检视装置
摄像设备
薄层色谱扫描仪(CS9301型）
7、操作技术
分类 自制薄层板
无黏合剂 含黏合剂
10%～15%煅石膏
0.2%～0.5%羧甲基纤维素钠水 溶液
1．薄层板 制备
市售薄层 板
操作方法
普通薄层板(玻璃、聚酰胺薄膜和铝基)
分类
高效薄层板（固定相粒径为5~7 ）um
操作方法
临用前一般应在110℃活化30分钟。聚酰胺薄膜不需活 化。铝基片薄层板和聚酰胺薄膜可根据需要剪裁
制板操作方法
• 将1份固定相和3份水（或羧甲基纤维素钠水 溶液）在研钵中沿同一方向研磨混匀，去除 表面的气泡后，置玻璃板上使涂布均匀，或 倒入涂布器（见图8-14）中，在玻板上平稳 地移动涂布器进行涂布(涂层厚度为0.2mm～ 0.3 mm)，取涂好的薄层板，置水平台上于室 温下晾干后，在110℃活化30分钟，立即置于 有干燥剂的干燥器中备用 。
薄层色谱（TLC） 纸色谱（PC) 薄膜色谱（TFC）
一、吸附色谱：利用吸附剂对被分离化合物分子 的吸附能力的差别而实现分离的一类色谱。
硅胶
氧化铝 活性炭 聚酰胺
吸附原理
物理吸附
化学吸附——碱 性化合物
液相色谱法的分离原理
液相色谱法的分离原理
液相色谱法（liquid chromatography, 简称LC）是一种基于溶液中被分离物质与固定相之间选择性相互作用力的色谱技术。
它利用固定在柱上的固体填充物（固定相）的特异性相互作用能力来实现样品中化合物的分离。
液相色谱法的分离原理主要包括以下几个方面：
1. 吸附色谱分离原理：这是最常见的液相色谱分离原理。
其基本原理是样品中的组分与填充柱固定相表面发生吸附作用，进而通过洗脱溶液中的移动相来实现物质的分离。
不同样品成分与固定相的相互吸附作用力的强弱决定了它们在柱中被保留的时间，从而实现分离。
2. 分配色谱分离原理：这种原理主要通过溶液中的物质在两个不同相之间的分配系数来实现分离。
柱内装有极性或非极性的液体填充物，移动相通过填充物时，样品中的成分会在两相之间进行不断地分配与再分配，从而实现分离。
3. 离子交换色谱分离原理：这种分离原理主要基于固定相上存在离子交换基团（阳离子或阴离子交换树脂）。
样品中的离子与交换基团之间发生离子交换反应，从而实现物质的分离。
离子交换色谱主要用于有机物或无机离子的分离和富集。
4. 凝胶过滤色谱分离原理：该原理利用固定相的孔隙大小与样品成分的分子量相比较，使分子小的物质能渗透进入孔隙内，而分子大的物质则在固定相表面滞留，从而实现分离。
总的来说，液相色谱法利用固定相与溶液中组分之间的相互作用力来实现样品的分离，不同的分离原理会根据具体的实验需求和样品特性来选择和优化。
色谱分离技术—亲和色谱分离技术
亲和层析介质
亲和配基
常用的亲和配基： 辅酶和磷酸腺苷
某些酶需要在辅酶存在的情况下才能表现出催化活性，即辅酶能与脱氢酶 和激酶之间通过亲和作用相互结合，因此这些辅酶可用作脱氢酶和激酶的亲和 配基。
主要的辅酶有NAD、NADP、ATP。
亲和层析介质
亲和配基
常用的亲和配基： 过度金属离子
铜、镍、锌等可与氮、硫、氧等供电原子产生配位键，因此可与蛋白质表 面的组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸吲哚基发生亲和结合作用。
的亲和能力有决定性影响。
亲和色谱法的操作方法
1.配基固相化（样品制备、装柱、平衡） 2.亲和吸附 3.解吸附 4.色谱柱再生
亲和色谱法的操作方法
1.配基固相化 将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和
吸附剂后装柱（称亲和柱），用一定pH和离子强度的缓冲液对柱子进行平衡。 2.亲和吸附
即进料和杂质清洗。将含有目标产物的料液连续通入亲和柱，目标产物吸 附在柱上，之后用缓冲液淋洗色谱柱除去未被吸附的杂蛋白。
亲和色谱法的操作方法
3.解吸附 解吸附即目标产物洗脱。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和
柱上的目的产物洗脱出来。
亲和色谱法的操作方法
4.色谱柱再生 用几倍体积的起始缓冲液进行再平衡，一般足以使亲和柱再生，但一些未
亲和层析介质
亲和层析介质由载体和配基组成
亲和载体
载体应具备的条件： 1.载体必须具有较好的理化稳定性和生物惰性，非专业吸附小。 2.具有大量可供活化和配基结合的化学基团，以供与配基共价连接之用。 3.载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。 4.载体必须有稀松的网状结构使大分子能自由进入。 5.载体要有良好的机械性能，颗粒均匀。
色谱分离法
第33页，共73页。
活性炭色谱法 操作步骤
• 1、装柱 • 2、上样 • 3、洗脱
第34页，共73页。
活性炭色谱法 操作提示
• （1）此法适用于分离水溶性成分如氨基酸、糖类及某
些苷类等，具有试样上柱量大，分离效果好等特点，且活 性炭价廉易得，适用于大量制备性分离。
• （2）目前尚无测定活性炭吸附力级别的理想方法，其吸
第7页，共73页。
基本知识：原理 分配色谱的原理
• 利用混合物中各成分在互不相溶的两相溶剂中分配系数 的不同而获得分离。两相溶剂中的一相需作为固定相， 常以某种惰性固体吸住该相溶剂，使之固定，这种吸 着了固定相溶剂的固体物质称为支持剂（也称载体或 担体）；另一相溶剂则作为移动相。
第8页，共73页。
H2C CH2
H2C CO
HN
CH2
H3C O H3C
CH3 O
CH3
HO
固定相
移动相
聚酰胺吸附色谱的原理
第38页，共73页。
聚酰胺色谱法
• 聚酰胺与各种化合物形成氢键的能力不同，决定了聚酰胺 对其吸附力的强弱。
• 形成氢键的能力首先与溶剂的种类有关。
• 其次，与在含水溶剂中，化合物分子结构对氢键缔合的 影响有关。
• 利用此性质，可使单糖与多糖分离，氨基酸与多肽分离， 水溶性芳香族化合物与脂肪族化合物分离等等。实际应 用时，应根据所分离物质的特性，选择吸附力适宜的活 性炭。
第32页，共73页。
活性炭色谱法 活性炭
• 色谱用活性炭常分为三类：粉末状活性炭、颗粒状 活性炭和锦纶活性炭。
• 粉末状活性炭吸附力最强，但在色谱过程中流速极慢， 需加压或减压操作；颗粒状活性炭在色谱过程中流速易 于控制，故色谱分离最常选用；锦纶活性炭吸附力最弱， 适于于分离用前两种活性炭不易洗脱的化合物。
活性炭色谱法 操作步骤
• 1、装柱 • 2、上样 • 3、洗脱
第34页，共73页。
活性炭色谱法 操作提示
• （1）此法适用于分离水溶性成分如氨基酸、糖类及某
些苷类等，具有试样上柱量大，分离效果好等特点，且活 性炭价廉易得，适用于大量制备性分离。
• （2）目前尚无测定活性炭吸附力级别的理想方法，其吸
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基本知识：原理 分配色谱的原理
• 利用混合物中各成分在互不相溶的两相溶剂中分配系数 的不同而获得分离。两相溶剂中的一相需作为固定相， 常以某种惰性固体吸住该相溶剂，使之固定，这种吸 着了固定相溶剂的固体物质称为支持剂（也称载体或 担体）；另一相溶剂则作为移动相。
第8页，共73页。
H2C CH2
H2C CO
HN
CH2
H3C O H3C
CH3 O
CH3
HO
固定相
移动相
聚酰胺吸附色谱的原理
第38页，共73页。
聚酰胺色谱法
• 聚酰胺与各种化合物形成氢键的能力不同，决定了聚酰胺 对其吸附力的强弱。
• 形成氢键的能力首先与溶剂的种类有关。
• 其次，与在含水溶剂中，化合物分子结构对氢键缔合的 影响有关。
• 利用此性质，可使单糖与多糖分离，氨基酸与多肽分离， 水溶性芳香族化合物与脂肪族化合物分离等等。实际应 用时，应根据所分离物质的特性，选择吸附力适宜的活 性炭。
第32页，共73页。
活性炭色谱法 活性炭
• 色谱用活性炭常分为三类：粉末状活性炭、颗粒状 活性炭和锦纶活性炭。
• 粉末状活性炭吸附力最强，但在色谱过程中流速极慢， 需加压或减压操作；颗粒状活性炭在色谱过程中流速易 于控制，故色谱分离最常选用；锦纶活性炭吸附力最弱， 适于于分离用前两种活性炭不易洗脱的化合物。
物质的色谱分离与吸收光谱分析方法
生物医药：用于分离和鉴定生物体内的物质，如药物、蛋白质和核酸等 环境监测：用于检测和鉴定环境中的有害物质，如污染物、农药和重金属等 食品安全：用于检测食品中的添加剂、农药残留和有害物质等 化学分析：用于分离和鉴定化学物质，如有机物、无机物和金属离子等
优势：色谱分离与光 谱分析结合可以提供 更准确的物质成分鉴 定结果，提高分析的 灵敏度和特异性。
PART FIVE
介绍环境样品分析中色谱分离和吸收光谱分析方法的应用原理。
列举实际应用案例，如大气、水体、土壤等环境样品中污染物的分离与检测。
分析这些方法在实际应用中的优缺点和适用范围。 探讨未来发展方向和挑战。
Байду номын сангаас
药物成分的分离与鉴定 药物质量控制与评价
药物生产过程的监控 药物代谢与动力学研究
食品中营养成分的检测 食品添加剂的检测 食品中农药残留的检测 食品新鲜度的检测
实验原理：基于物质对光的吸收、发射或散射特性进行物质分析的方法 实验步骤：样品制备、光谱采集、数据处理与分析 实验仪器：光谱仪、光源、单色器、样品池等 实验条件：温度、压力、湿度等环境因素对光谱的影响
数据采集：利用色谱分离技术对物质进行分离，并记录各组分的吸收光谱 数据处理：对采集的数据进行预处理，包括去噪、平滑化等操作 数据分析：根据处理后的数据，分析各组分的含量及光谱特征 结果呈现：将分析结果以图表、表格等形式展示，便于观察和比较
吸光度定义：物质对光的吸收程度
吸光度测量方法：使用分光光度计， 调整波长测定吸光度值
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
吸光度与浓度关系：线性关系，可 用于定量分析
注意事项：选择合适的波长范围， 避免干扰物质的影响
气相色谱分离方法
气相色谱分离方法嘿，朋友们！今天咱就来聊聊气相色谱分离方法。
这玩意儿啊，就像是一个超级大厨，能把各种混合物分得清清楚楚。
你看啊，气相色谱就好比一场精彩的魔术表演。
混合物就像是一堆乱七八糟的道具，而气相色谱仪呢，就是那个神奇的魔术师。
它通过各种巧妙的手段，把这些道具按照各自的特性给分离开来。
比如说，咱家里做菜用的调料，盐啊、糖啊、花椒粉啊啥的，要是混在一起，咱怎么分得出来呢？气相色谱就能做到！它能准确地把每一种成分都给揪出来。
这其中的关键啊，就是那根柱子。
这柱子可不得了，就像一条神奇的通道，混合物从这头进去，出来的时候就被分得明明白白了。
不同的成分在柱子里的“跑动速度”不一样，就像跑步比赛似的，跑得快的先冲过终点线，跑得慢的就落在后面啦。
而且啊，气相色谱分离方法的应用那可太广泛了。
在化学实验室里，科学家们用它来分析各种复杂的化合物，就像侦探在寻找线索一样。
在制药行业，它能确保药品的质量和纯度，这可不是开玩笑的，关系到咱们的健康呢！在环境监测中，它能检测出空气中的污染物，让我们知道环境是不是被污染了。
想想看，如果没有气相色谱，那得有多混乱啊！就好比你去超市买东西，所有东西都堆在一起，你怎么找你想要的那个呀？操作气相色谱仪也挺有意思的。
你得像对待一个宝贝似的，小心翼翼地调整各种参数。
温度啦、流速啦，都得恰到好处，不然可就得不到准确的结果咯。
这就像烤蛋糕，温度太高或太低，蛋糕可就烤不好啦。
还有哦，样品的准备也很重要呢。
要是样品没处理好，就像给魔术师一堆乱七八糟的道具，那他怎么表演好魔术呀？总之呢，气相色谱分离方法真的是太神奇、太有用啦！它就像我们生活中的一个小助手，默默地为我们解决各种难题。
它让我们对这个世界的认识更加清晰，让我们的生活更加美好。
难道你不想多了解了解它吗？相信我，一旦你深入了解了它，你一定会被它的魅力所吸引！。
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此外，对于碱性物质可发生不可逆吸附。因此， 对一些碱性物质在使用硅胶进行层析时，有必要进行 预实验。
如在硅胶中拌入15％左右的硝酸银，这种加硝酸 银的硅胶对有机物中不饱和键有特殊的吸附性，因此 ，常用它分离一些不饱和化合物。
柱色谱（Column Chromatography）
3.2 洗脱剂的选择
选择原则：
凝胶 凝胶基质 珠
小分子 大分子
凝胶过滤层析过程示意图
凝胶色谱
❖ 单次展开法和多次展开法 ❖ 单向展开法和双向展开法
吸附色谱 显色
❖ 显色也称定位，即用某种方法使经色谱展开后的 混合物斑点呈现颜色，以便观察其位置
(1) 紫外线照射法 (2) 喷雾显色法 (3) 碘蒸汽显色法 (4) 生物显迹法
柱色谱
洗脱液
样品 填充物 玻璃柱
分部收集
柱色谱（Column Chromatography）
❖ 薄层色谱法选择的主要吸附剂为氧化铝、硅胶和聚酰 胺。色谱用的吸附剂要求一定的形状与粒度范围，不 同吸附剂用于分离不同类型的化合物。吸附剂还必须 具有一定的活度，活度太高或过低都不能使混合物各 组分得到有效的分离。
吸附色谱
展开剂
❖在吸附色谱中，组分的展开过程涉及吸附剂、被 分离化合物和溶剂三种之间的相互竞争。其基本 原则主要有两个：①展开剂对被分离组分有一定 的解吸能力，但又不能太大。②展开剂应该对被 分离的物质有一定的溶解度。
3.1 吸附剂的选择
实验室常用
氧化 铝
硅胶
氧化 活性 镁炭
吸附剂要求： 不能与被分离的物质和展开剂发生化学作用 吸附剂的粒度大小要均匀
柱色谱（Column Chromatography）
⑴ 氧化铝（alumina）
氧化铝的吸附活性来源于铝原子上未成键电子对。氧化铝的 活性与含水量有关，含水量越低，活性越大，吸附力越强。无 水氧化铝吸附活性特别强。根据氧化铝的含水量可将氧化铝的 活性分为五级 。
将展开剂（一般2～10mL）倒入层析缸。放置一定 时间，待层析缸被展开剂饱和后，再迅速将薄层板 放入，密闭，展开即开始，这样可防止边缘效应产 生。另外，注意在薄板放入层析缸时，切勿使溶剂 浸没样品点。当溶剂移动到接近薄层上端边缘时， 取出薄板，划出溶剂前沿。
吸附色谱
❖ 上行展开法和下行展开法 最常用的展开法是上行展开，就是 使展开剂从下往上爬行展开；下行展开是使展开剂由上向下流 动。由于受重力作用，下行展开移动较快。
❖常用溶剂极性次序为：己烷<环己烷<四氯化碳<甲 苯<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<正丙醇<乙醇< 甲醇<水<冰醋酸
吸附色谱
吸附剂与洗脱机选择的选择
❖ 吸附剂应有最大的比表面积和足够的吸附能力，它对 欲分离的不同物质应该有不同的解吸能力；与洗脱剂 、溶剂及样品组分不会发生化学反应；还要求所选的 吸附剂颗粒均匀，在操作过程中不会破裂。
器
色谱概述
色谱法的优点 （1）分离效率高。 （2）应用范围广。
（3）分析速度快。
（4）样品用量少。 （5）灵敏度高。 （6）分离和测定一次完成。和多种波谱分析仪器联用 （7）易于自动化，可在工业流程中使用。
色谱法的缺点是处理量小、操作周期长、不能连续操作。
色谱法的分类
色谱法的分类
根据操作压力的不同分类： 低压色谱：操作压力<0.5MPa 中压色谱：操作压力0.5～4.0MPa 高压色谱：操作压力4.0～40MPa
色谱概述
层析柱——径高比（10：1—1：100）、材质（玻璃、有机 玻璃、PVC、不锈钢等）、耐压（0.05－10 MPa）等
泵——恒速、压力（蠕动泵等） ❖ 馏分收集仪 n 检测仪
1) 通用型—示差折光、介电常数、电导等 2) 专用型—紫外、荧光、放射性检测器等
n 记录仪、工作站—色谱参数的选择和设定、自动化操作 、色谱数据的采集和存储，并作实时处理、数据后处理 、自动打印出一套完整的色谱分析数据……
❖ 加样，洗脱剂冲洗
❖ 各组分与固定相无作 用力——与洗脱剂一 起流动，得不到分离 ；
❖ 各组分与固定相有一 定作用力——移动速 率低于流动相。
❖ 各组分与固定相的作 用力大小不同——移 动速率不同，作用力 大，移动慢，各组分 得到分离。
色谱概述
色谱概述
❖ 1903年 Tswett创立色谱法（在碳酸钙上分离了叶绿素）。由 Tswett创立的色谱法分离效率低，分离时间长，根据样品的不同 ，一般分离需要几小时至几天。
碱性氧化铝（pH9～10），适用于碱性，如生物碱 和中性化合物的分离。
31
柱色谱（Column Chromatography）
⑵ 硅胶（silicagel）
吸附性来源于硅胶氧原子上未成键的电子对和可以形成氢键 的羟基。羟基有结合型（Ⅰ）、活性型（Ⅱ）和游离型（Ⅲ） 三种。
柱色谱（Column Chromatography）
❖ ◆20世纪40年代至50年代初，先后出现了纸色谱）和薄膜色谱 法。 特点：较经典色谱法简单、分离时间短，样品量要求小。
❖ ◆1952年，James和Martin提出了气相色谱法（GC) 特点： 以气体作为流动相。应用范围广泛受到人们重视。但对 不易气化和热不稳定性差的化合物难以分离。
❖ 20世纪60年代后期由于新型色谱柱填料的，高压输液泵和高灵 敏度的监测器的出现，发展出了高效液相色谱（HPLC）。
色谱概述
❖1941 Martin和Synge提出液-液色谱理论； ❖1952 James和Martin发展了气相色谱； ❖1956 Van Deemter提出速率理论； ❖1967 Kirkland等研制高效液相色谱法；
80年代以后出现毛细管电泳和毛细管电动色谱等一 系列新的色谱分析方法。
色谱概述
如果将硅胶在200℃以上长时间强热后，则硅原子上结合 的羟基发生脱水而形成硅氧烷型（Ⅳ），这种不含羟基的硅氧 烷型的硅胶吸附性极差。
柱色谱（Column Chromatography）
硅胶，通常视为酸性吸附剂。一般用来分离一些 酸性和中性有机物。如有机酸、萜类、氨基酸、甾类 和一些甙类。
但是，对某些酸性弱的试样，在色层中有分解的 危险。
活性
氧化铝含水量（%）
硅胶含水量（%）
Ⅰ
0
0
Ⅱ
3
5
Ⅲ
8
15
Ⅳ
10
25
Ⅳ
15
38
柱色谱（Column Chromatography）
⑴ 氧化铝（alumina）
酸性氧化铝（pH=5～4），适用于分离酸性化合物 和对酸稳定的中性化合物，如酚类物质和某些氨基 酸类等。
中性氧化铝（pH＝7.5），适用与分离生物碱、挥 发油、萜类、甾类、蒽醌以及在酸碱中不稳定甙类 、酯、内酯等化合物。凡是能用酸性或碱性氧化铝 层析分离的物质，中性氧化铝也都适用。
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现代分离科学与技术
Modern Separation Science and Technique 色谱分离
Contents
1. 色谱分离概述 2. 色谱分离分类 3. 常用的色谱分离方法 6. 新型色谱分离技术
色谱概述
色谱（chromatography） 分离技术是一类分离方 法的总称，又称色谱法、 层析法、层离法等。它 是利用不同组分在固定 相和流动相中的物理化 学性质的差别，使各组 分在两相中以不同的速 率移动而进一步分离的 技术。
色谱概述ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
岛津高效液相检测器
❖ SPD-20A/V 紫外可见双波长检测器 ❖ SPD-M20A 二极管阵列检测器（PDA） ❖ RF-20A/xs 荧光检测器 ❖ RID-10A 示差折光检测器 ❖ CDD-10Avp 电导检测器 ❖ ELSD-LTⅡ 蒸发光散射检测器 ❖ ECD 电化学检测器 ❖ Radiochromatography Detector 放射性同位素检测
吸附色谱
点样
❖用一根玻璃毛细管或点样器，吸取样品溶液，在距薄 层一端约2cm的起始线上点样，每点间距约2cm，样 品点直径一般小于0.5cm。注意点样量要适中，太少 时，某些成分不能被检出；太多时容易产生拖尾现象 ，即每个斑点都拉得很长，互相重叠，不能分开。
吸附色谱
展开 ❖ 展开操作需要在密闭的容器中进行。配好展开剂，
极性大的洗脱剂对极性大和 小的组分洗脱能力都很强
取决于样品各组分的极性；
极性小的组分用极性小的洗脱剂进行洗脱；
极性大的组分用极性大的洗脱剂进行洗脱。
除单一溶剂外，也可采用混合溶剂，或采用梯度（开始是低极 性溶剂，后面是高极性溶剂）
凝胶色谱
❖凝胶色谱是基于分子大小不同而进行分离的一种分 离技术，又称之凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛 过滤、阻滞扩散层析或排阻层析。它具有一系列的 优点：操作方便、不会使物质变性、适用于不稳定 的化合物、凝胶不用再生、可反复使用。缺点：分 离速度较慢。
❖洗脱剂原则上要求所选的洗脱剂纯度合格，与样品 和吸附剂不起化学反应，对样品的溶解度大，粘 度小，容易流动，容易与洗脱的组分分开。
吸附色谱
❖ 常用的洗脱剂
饱和的碳氢化合物、醇、酚、酮、醚、卤代烷、有机酸等。选 择吸附剂时，可根据样品的溶解度、吸附剂的种类、溶剂极 性等方面考虑，极性大的洗脱能力大，因此可先用极性小的 作洗脱剂，使组分容易被吸附，然后换用极性大的溶剂作洗 脱剂，使组分容易从吸附柱中洗出。
吸附色谱
吸附色谱法(adsorption chromatography，AC)是靠 溶质与吸附剂之间的分子吸附力的差异而分离 的方法。吸附色谱的固定相为固体吸附剂，如 有较强极性硅胶、中等极性氧化铝、非极性炭 及特殊作用的分子筛等。
吸附色谱
基本原理
❖ 吸附色谱是靠溶质与吸附剂之间的分子吸附力的差异而分离 的方法。吸附力主要是范德华力，有时也可能形成氢键或化 学键。吸附法的关键是选择吸附剂和展开剂。
如在硅胶中拌入15％左右的硝酸银，这种加硝酸 银的硅胶对有机物中不饱和键有特殊的吸附性，因此 ，常用它分离一些不饱和化合物。
柱色谱（Column Chromatography）
3.2 洗脱剂的选择
选择原则：
凝胶 凝胶基质 珠
小分子 大分子
凝胶过滤层析过程示意图
凝胶色谱
❖ 单次展开法和多次展开法 ❖ 单向展开法和双向展开法
吸附色谱 显色
❖ 显色也称定位，即用某种方法使经色谱展开后的 混合物斑点呈现颜色，以便观察其位置
(1) 紫外线照射法 (2) 喷雾显色法 (3) 碘蒸汽显色法 (4) 生物显迹法
柱色谱
洗脱液
样品 填充物 玻璃柱
分部收集
柱色谱（Column Chromatography）
❖ 薄层色谱法选择的主要吸附剂为氧化铝、硅胶和聚酰 胺。色谱用的吸附剂要求一定的形状与粒度范围，不 同吸附剂用于分离不同类型的化合物。吸附剂还必须 具有一定的活度，活度太高或过低都不能使混合物各 组分得到有效的分离。
吸附色谱
展开剂
❖在吸附色谱中，组分的展开过程涉及吸附剂、被 分离化合物和溶剂三种之间的相互竞争。其基本 原则主要有两个：①展开剂对被分离组分有一定 的解吸能力，但又不能太大。②展开剂应该对被 分离的物质有一定的溶解度。
3.1 吸附剂的选择
实验室常用
氧化 铝
硅胶
氧化 活性 镁炭
吸附剂要求： 不能与被分离的物质和展开剂发生化学作用 吸附剂的粒度大小要均匀
柱色谱（Column Chromatography）
⑴ 氧化铝（alumina）
氧化铝的吸附活性来源于铝原子上未成键电子对。氧化铝的 活性与含水量有关，含水量越低，活性越大，吸附力越强。无 水氧化铝吸附活性特别强。根据氧化铝的含水量可将氧化铝的 活性分为五级 。
将展开剂（一般2～10mL）倒入层析缸。放置一定 时间，待层析缸被展开剂饱和后，再迅速将薄层板 放入，密闭，展开即开始，这样可防止边缘效应产 生。另外，注意在薄板放入层析缸时，切勿使溶剂 浸没样品点。当溶剂移动到接近薄层上端边缘时， 取出薄板，划出溶剂前沿。
吸附色谱
❖ 上行展开法和下行展开法 最常用的展开法是上行展开，就是 使展开剂从下往上爬行展开；下行展开是使展开剂由上向下流 动。由于受重力作用，下行展开移动较快。
❖常用溶剂极性次序为：己烷<环己烷<四氯化碳<甲 苯<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<正丙醇<乙醇< 甲醇<水<冰醋酸
吸附色谱
吸附剂与洗脱机选择的选择
❖ 吸附剂应有最大的比表面积和足够的吸附能力，它对 欲分离的不同物质应该有不同的解吸能力；与洗脱剂 、溶剂及样品组分不会发生化学反应；还要求所选的 吸附剂颗粒均匀，在操作过程中不会破裂。
器
色谱概述
色谱法的优点 （1）分离效率高。 （2）应用范围广。
（3）分析速度快。
（4）样品用量少。 （5）灵敏度高。 （6）分离和测定一次完成。和多种波谱分析仪器联用 （7）易于自动化，可在工业流程中使用。
色谱法的缺点是处理量小、操作周期长、不能连续操作。
色谱法的分类
色谱法的分类
根据操作压力的不同分类： 低压色谱：操作压力<0.5MPa 中压色谱：操作压力0.5～4.0MPa 高压色谱：操作压力4.0～40MPa
色谱概述
层析柱——径高比（10：1—1：100）、材质（玻璃、有机 玻璃、PVC、不锈钢等）、耐压（0.05－10 MPa）等
泵——恒速、压力（蠕动泵等） ❖ 馏分收集仪 n 检测仪
1) 通用型—示差折光、介电常数、电导等 2) 专用型—紫外、荧光、放射性检测器等
n 记录仪、工作站—色谱参数的选择和设定、自动化操作 、色谱数据的采集和存储，并作实时处理、数据后处理 、自动打印出一套完整的色谱分析数据……
❖ 加样，洗脱剂冲洗
❖ 各组分与固定相无作 用力——与洗脱剂一 起流动，得不到分离 ；
❖ 各组分与固定相有一 定作用力——移动速 率低于流动相。
❖ 各组分与固定相的作 用力大小不同——移 动速率不同，作用力 大，移动慢，各组分 得到分离。
色谱概述
色谱概述
❖ 1903年 Tswett创立色谱法（在碳酸钙上分离了叶绿素）。由 Tswett创立的色谱法分离效率低，分离时间长，根据样品的不同 ，一般分离需要几小时至几天。
碱性氧化铝（pH9～10），适用于碱性，如生物碱 和中性化合物的分离。
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柱色谱（Column Chromatography）
⑵ 硅胶（silicagel）
吸附性来源于硅胶氧原子上未成键的电子对和可以形成氢键 的羟基。羟基有结合型（Ⅰ）、活性型（Ⅱ）和游离型（Ⅲ） 三种。
柱色谱（Column Chromatography）
❖ ◆20世纪40年代至50年代初，先后出现了纸色谱）和薄膜色谱 法。 特点：较经典色谱法简单、分离时间短，样品量要求小。
❖ ◆1952年，James和Martin提出了气相色谱法（GC) 特点： 以气体作为流动相。应用范围广泛受到人们重视。但对 不易气化和热不稳定性差的化合物难以分离。
❖ 20世纪60年代后期由于新型色谱柱填料的，高压输液泵和高灵 敏度的监测器的出现，发展出了高效液相色谱（HPLC）。
色谱概述
❖1941 Martin和Synge提出液-液色谱理论； ❖1952 James和Martin发展了气相色谱； ❖1956 Van Deemter提出速率理论； ❖1967 Kirkland等研制高效液相色谱法；
80年代以后出现毛细管电泳和毛细管电动色谱等一 系列新的色谱分析方法。
色谱概述
如果将硅胶在200℃以上长时间强热后，则硅原子上结合 的羟基发生脱水而形成硅氧烷型（Ⅳ），这种不含羟基的硅氧 烷型的硅胶吸附性极差。
柱色谱（Column Chromatography）
硅胶，通常视为酸性吸附剂。一般用来分离一些 酸性和中性有机物。如有机酸、萜类、氨基酸、甾类 和一些甙类。
但是，对某些酸性弱的试样，在色层中有分解的 危险。
活性
氧化铝含水量（%）
硅胶含水量（%）
Ⅰ
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柱色谱（Column Chromatography）
⑴ 氧化铝（alumina）
酸性氧化铝（pH=5～4），适用于分离酸性化合物 和对酸稳定的中性化合物，如酚类物质和某些氨基 酸类等。
中性氧化铝（pH＝7.5），适用与分离生物碱、挥 发油、萜类、甾类、蒽醌以及在酸碱中不稳定甙类 、酯、内酯等化合物。凡是能用酸性或碱性氧化铝 层析分离的物质，中性氧化铝也都适用。
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现代分离科学与技术
Modern Separation Science and Technique 色谱分离
Contents
1. 色谱分离概述 2. 色谱分离分类 3. 常用的色谱分离方法 6. 新型色谱分离技术
色谱概述
色谱（chromatography） 分离技术是一类分离方 法的总称，又称色谱法、 层析法、层离法等。它 是利用不同组分在固定 相和流动相中的物理化 学性质的差别，使各组 分在两相中以不同的速 率移动而进一步分离的 技术。
色谱概述ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
岛津高效液相检测器
❖ SPD-20A/V 紫外可见双波长检测器 ❖ SPD-M20A 二极管阵列检测器（PDA） ❖ RF-20A/xs 荧光检测器 ❖ RID-10A 示差折光检测器 ❖ CDD-10Avp 电导检测器 ❖ ELSD-LTⅡ 蒸发光散射检测器 ❖ ECD 电化学检测器 ❖ Radiochromatography Detector 放射性同位素检测
吸附色谱
点样
❖用一根玻璃毛细管或点样器，吸取样品溶液，在距薄 层一端约2cm的起始线上点样，每点间距约2cm，样 品点直径一般小于0.5cm。注意点样量要适中，太少 时，某些成分不能被检出；太多时容易产生拖尾现象 ，即每个斑点都拉得很长，互相重叠，不能分开。
吸附色谱
展开 ❖ 展开操作需要在密闭的容器中进行。配好展开剂，
极性大的洗脱剂对极性大和 小的组分洗脱能力都很强
取决于样品各组分的极性；
极性小的组分用极性小的洗脱剂进行洗脱；
极性大的组分用极性大的洗脱剂进行洗脱。
除单一溶剂外，也可采用混合溶剂，或采用梯度（开始是低极 性溶剂，后面是高极性溶剂）
凝胶色谱
❖凝胶色谱是基于分子大小不同而进行分离的一种分 离技术，又称之凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛 过滤、阻滞扩散层析或排阻层析。它具有一系列的 优点：操作方便、不会使物质变性、适用于不稳定 的化合物、凝胶不用再生、可反复使用。缺点：分 离速度较慢。
❖洗脱剂原则上要求所选的洗脱剂纯度合格，与样品 和吸附剂不起化学反应，对样品的溶解度大，粘 度小，容易流动，容易与洗脱的组分分开。
吸附色谱
❖ 常用的洗脱剂
饱和的碳氢化合物、醇、酚、酮、醚、卤代烷、有机酸等。选 择吸附剂时，可根据样品的溶解度、吸附剂的种类、溶剂极 性等方面考虑，极性大的洗脱能力大，因此可先用极性小的 作洗脱剂，使组分容易被吸附，然后换用极性大的溶剂作洗 脱剂，使组分容易从吸附柱中洗出。
吸附色谱
吸附色谱法(adsorption chromatography，AC)是靠 溶质与吸附剂之间的分子吸附力的差异而分离 的方法。吸附色谱的固定相为固体吸附剂，如 有较强极性硅胶、中等极性氧化铝、非极性炭 及特殊作用的分子筛等。
吸附色谱
基本原理
❖ 吸附色谱是靠溶质与吸附剂之间的分子吸附力的差异而分离 的方法。吸附力主要是范德华力，有时也可能形成氢键或化 学键。吸附法的关键是选择吸附剂和展开剂。