5个酵母电转化方案
5个电转化方案
方法一：高效
1.收集菌体
取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中，4℃、10000g 离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。
2.菌体处理
加入1ml处理液，室温下放置20min。
处理液：
10mM LiAc
10mM DTT
0.6M sorbitol
10mM TrisHCl(pH7.5)
3.离心，弃上清，加入1ml 1M sorbitol ，离心，弃上清，
4.用1M sorbitol洗涤二次，到最终体积约为80μl.（菌体太多可适当弃去部分）
5.加入10μl.经过BglⅡ酶切处理的工程质粒，混匀后转入电击杯中，冰浴5min.
6.电转. 1.5kv，25μF，200Ω条件下进行电转。
7.电击后立刻加入1mL 1M sorbitol，吸出后于30℃培养2h。
8.取一定量涂平板(YPDS + Zeocin，涂布的量分别为100、200微升，剩余的经离心处理后全部涂在一个平板上)
有一点要注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。
方法二：按下面步骤转化,开始每个板子只长了一二十菌落;小细节修改后,每个板长了约100个.
步骤如下：
1、目的DNA（pPIC9K)，经电泳检测已经线性化（SalI酶切）；
2、DNA纯化方法是经酚仿－氯仿两步抽提后，无水乙醇沉淀的，目测定量应足够；
3、GS115甘油菌经新鲜平板复苏后，5ML培养过夜，16h左右后，取菌1：100稀释，接种于70ml菌液扩大培养，14h后测得OD600约1.3左右。
4、将sorbital、水和菌液均冰浴；
5、菌液离心5min－100ml冰水洗涤－50ml冰水洗涤－4ml sorbital洗涤，然后溶解于300ul 冰sorbital；
6、加入约5～10ug的DNA，枪吹匀，置0.2CM电转杯静置5min；
7、电击，1,5KV.
8、立即加入1ml冰浴的sorbital，静止10min。
9、取100ul转化液，涂布10cm的MD平板。
做了一点修改每块板子大概能长100来个菌落（一般需要2天左右）：
1、菌液收集时间：以前可能是OD值测得不太准确，我然后把菌液分别做了1、
2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系。1、菌液测OD值时，建议将菌液稀释不同浓度测定，这样才准确些。菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能就是你的OD稀释倍数不够！你分别稀释2倍、4倍、8倍、10倍等，每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD 值是否准确！
2、我开始是先挑单克隆于5mlYPD中，过夜16h后，转接于50ml YPD中，培养大概18个小时吧。OD值是否测准可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心
5min）约0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。
3、电击条件等上面帖子上都有，1.5kv，放电4.8～5.5ms。
2、其它做法相同，就是感受态做好后，最后一次吸出sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。
3、最后用毛细管取出100ul出来，加入质粒，混匀！（我以前怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。）
4、MD板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。
5、你说的YNB，我用的是成品，只需要直接配制。42度水浴一会，然后过滤除菌。我没有加硫酸铵。YNB是加到培养基里面的，去离子水pH偏低哦，我建议直接用蒸馏水就可以了（关系不是太大）。
方法三：简便独特
在筛选高表达菌种中，与大多数人和说明书有区别(成功做出几个基因):
每次转化前，均用多种酶BlgII/salI/sacI同时切，转化时，用GS115/KM71/KM71H同时转化，转化的条件也和大家一样，即1.5/25/200,但是我用的是0.1的杯子，不是0.2的，转化后涂MM及YPD+0.25G，长出菌落后，即进行大规模的表达试验，直接用YPD表达的，一般48h后即进行大量的SDS-PAGE鉴定，鉴定时，样品不用浓缩，直接上样，看到目的带后再做PCR，测序。
方法四：没有转化子（无aa的YNB和硫酸铵称好后，去离子水溶解，然后高压灭菌）
1.挑取酵母单菌落，接种至含有50ml YPD培养基的三角瓶中，30℃、250-300rpm培养过夜约14h，OD600约1.3
2.菌液离心5min－50ml冰水洗涤－25ml冰水洗涤－2ml sorbital洗涤，然后溶解于200ul 冰sorbital；两管分装，每管100ul
3.加入约5～10ug的线性化的DNA20ul，枪吹匀，置0.2CM电转杯冰浴5min；
4.电击，1,5KV.使用的是Eppendorf 2510，用于转化细菌及酵母。
5.立即加入1ml冰浴的sorbital，静止1h。
将菌体悬液涂布于MD平板上，每300μl涂布一块平板；
方法五: 和Invitrogen公司说明书差不多的方法
X33菌株于100ml YPD摇到OD600约1.1-1.3，太高影响感受态效率
(1) 1500－1700g离心5min，将离心管倒置在吸水纸上轻轻控几下，充分弃上清
(2) 加入100ml 冰浴的超纯水ddH2O，可在振荡器上振荡混匀，可静置3－5分钟
(3) 离心，弃上清，再加100ml ddH2O洗一遍
(4) 离心，弃上清，加20ml 冰浴1M Sorbitol洗一遍
(5) 离心，弃上清，菌体置于冰浴中，加入约100－200ul Sorbitol混匀
加入Sorbitol量需自己调整，这时菌液很浓，只要能够用200ul黄枪头吸出来就可以了，一般共有约400－500ul，够做几管感受态了。
(7) 吸取100－150ul感受态到线性化的DNA中，用枪头打匀或手指弹匀
静置5min，于2mm电转化杯中，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400），一般放电时间在4.5-4.9ms之间，小于4说明你的DNA盐浓度太高
(9) 立即加入1ml Sorbitol，转入10ml 离心管，30度静置1小时，然后加入1ml YPD，30度，200rpm摇1小时，取50－200ul菌液涂100ul/ml YPDS板
(10) 一般转化效率可以达到：200个以上转化子每200ul菌液，足够筛选表达菌株了。
方法六:酵母感受态细胞的制备
⑴接种Pichia pastoris GS115于5 ml YPD液体培养基，30℃，250~300250 rpm ，过夜。
⑵取200μl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的三角摇瓶中，28~30℃、250~300r/min 培养过夜，一般12小时左右。
⑶将细胞培养物于4℃，5000g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
⑷按步骤3离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
⑸按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；
⑹按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为2ml；
⑺NOTE：可将其分装为200μl一份的包装冷冻起来，但如果保存时间过长会影响其转化效率。
毕赤酵母化学转化
（化学转化） 如果没有电转仪，LiCl转化是一种可供选择的方法，转化率是102到103cfu/ug。 主要过程为： 取过夜活化培养的菌液按1：1000接种于15ml新鲜的YPD液体培养基，30℃培养至OD600达到0.8-1.0；4℃，4500rpm离心5分钟，用8ml冰预冷的无菌水洗涤菌体，倾除洗涤液，用1mL ，4℃，4500rpm离心5分钟，沉淀用50μl冰预冷的100mmol/L LiCl悬浮，最后定容至80-90ml。 LiCl转化取适量单链鲑精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上备用，取上述制备好的感受态细胞12 000rpm，离心15s，吸弃LiCl溶液，按顺序依次加入 50%PEG 240ml 1mmol/L LiCl 36 ml 单链鲑精DNA 25ml 线性化质粒DNA 10 ml (约10mg) 用吸头反复吹打，使细胞沉淀与加入的溶液混匀，30℃静置温育30min，42℃热击20-25min，4500rpm离心10min，吸弃转化液，细胞沉淀加1ml YPD培养基于30℃200 rpm培养2-4hr，取转化混合液100ml涂布含100μg/mL ZeocinTM 的YPDS平板，30℃培养2-3天。 LiCl 转化方法 作为电转化的替代方法，在线性化DNA条件下，转化效率介于102~103cfu/ug 之间 溶液： 1M LiCl 用无离子水溶解，过滤除菌。（稀释使用无菌水。） 50% PEG 3350 无离子水溶解，过滤除菌，密封保存 2mg/ml变性的鲑精DNA片段（10mM Tris-HCl，pH 8.0,10mM EDTA）-20℃保存。 准备感受态细胞： 1.在50ml YPD中，培养至OD600 在0.8~1.0之间（大约108个/ml）。 2.收集细胞，用25ml无菌水洗涤，1500g室温离心10min。 3.重悬细胞于1ml 体积的100mMLiCl中，将悬液转移至1.5ml离心管中。 4.使用最大转速离心15s，吸去LiCl上清。 5.重悬细胞于400ul体积的100mMLiCl中。 6.每个转化组取50ul细胞悬液置于1.5ml离心管中，立即使用。勿要存于冰上或冻存于 -20℃。 转化： 1.取1ml单链DNA鲑鱼精标准煮沸5min，后快速于冰上降温并存于冰上。注意：不需要 也不推荐在每次使用前煮沸载体DNA。分装冻存于-20℃，并且每使用3-4次后再次煮沸更加适宜。 2.离心上面步骤6的细胞，吸去残留的LiCl。 3.每次转化都要向细胞中顺次加入下列试剂。PEG可以保护细胞不会因高浓度的LiCl而受 到损伤。 I.240 ul50% PEG 3350 II.36 ul 1M LiCl III.25 ul 2mg/ml 单链鲑鱼精DNA IV.质粒DNA（5~10ul）溶于50ul无菌水中。
2021年毕赤酵母表达系统资料整理
毕赤酵母表达系统 欧阳光明（2021.03.07） Mut+和Muts 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长(去抑制)时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖)培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h。Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。
菌株GS115、X-33、KM71和SMD1168的区别 GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。GS115、KM71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点(His4)有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts(载体取代AXO1基因)，可以在MM和MD培养基上鉴定表型。SMD1168和GS115类似，但SMD1168基因组中的Pep4基因发生突变，是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。 其中X-33由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而X33与GS115一样都是属于MUT＋表现型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响， KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因(arg4)有突变，在不含精氨酸的培养基中不能生长。用野生型ARG4基因(约2kb)插入到克隆的野生型AOX1基因的BamHI(AOX1基因15/16密码子)及SalI(AOX1基因227/228密码子)位点，取代了AOX1基因16-227密码子，此结构转化至KM71亲本菌(arg4his4)中，分离产生KM71
!!酵母双杂交操作步骤(中文翻译)
各种SD培养基： 1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？ “四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ; 葡萄糖20g (即2%) 2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4)SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 5)SD/-trp (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。 实际配制的方法是： 1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃ 以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（李博士的经验大 约加10M NaOH 200ul即可），之后补水至950 ml。 3.高压完后待温度降至55℃以下，加入50 ml40%葡萄糖。
GS115毕赤酵母PEG感受态细胞
https://www.360docs.net/doc/a017707560.html, GS115 毕赤酵母PEG感受态细胞 组成规格： 货号名称规格数量 GT2504 GS115酵母感受态细胞50ul 20支 GT2505 GS115酵母感受态细胞50ul 50支 GT2506 GS115酵母感受态细胞50ul 100支 为了满足广大科研工作者对大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母和农杆菌等菌种感受态细胞的需求，华越洋现推出各种系列的感受态细胞供大家选择。 毕赤酵母感受态细胞试剂盒 1 介绍 本试剂盒包括酵母感受态细胞、Solution 1和Solution 2。其中酵母感受态细胞是用于转化的细胞，需-70度低温保存；Solution 1和Solution2为转化时使用的试剂，均为无菌，需-20度保存，使用时解冻即可。本酵母感受态细胞采用专利技术制备的感受态，有别于传统山梨醇制备的感受态细胞，并配有Solution 1和Solution 2，可直接用于热击法转化，而不需要使用电转仪和电击杯。本方法是电击法的替代方法，也避免了LiCl方法需要现制备感受细胞的繁琐。转化效率可以达到102-103cfu/ug线性化DNA，经本公司反复验证-80保存6个月不影响转化效率。 2 转化步骤 2.1 线性化质粒片段的制备 取过夜培养的质粒菌种3ml,使用质粒抽提试剂盒抽提质粒，最后溶解于50ul的TE或水中。将所有的质粒片段在200μl的体系中酶切线性化。用酚氯仿试剂去除蛋白并且浓度片段至20ul体系中（保证有100μg的质粒片段）。 2.2 转化 2.2.1直接加于冻结的酵母细胞中，以获得最大转化率；（注意加入至冻结的细胞中，而不是解冻的细胞中）； 2.2.2. 加入后迅速放入37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次； 2.2. 3. 取出离心管，加入1.5ml Solution 1，彻底混匀；(注意可以弹或移液器轻轻混合，不可用移液器剧烈来回混合也不可用涡旋振荡器) ； 2.2.4. 30℃水浴孵育1h； 2.2.5. 室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml Solution 2中； 2.2.6. 离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml Solution 2中； 2.2.7. 将所有转化液铺于选择性平板（例如MD板），于30℃孵育3～4天后，鉴定；
酵母转化问题参考
5 Ways to Destroy Your Yeast Transformation by Emily Crow on 27th of July, 2011 in Cell / Tissue Culture Transforming yeast with DNA is a very similar process to transforming E. coli, but with just enough differences to trip you up if you let your attention slip. Whether you’re doing a yeast two-hybrid screen, or using yeast as a model system, here are a some mistakes to to avoid… 1. Forgetting to add single stranded DNA While E. coli readily takes up double-stranded DNA, yeast requires the addition of single-stranded “carrier DNA” to enhance uptake of your plasmid or fragment. If you only add your plasmid to the transformation mix, chances are you’ll be confronted with a pristinely sterile plate after three days of incubation. 2. Using old PEG PEG (polyethylene glycol) is a crucial ingredient in the yeast transformation buffer. Unfortunately, it’s annoying to make and goes bad quickly. The percentage of PEG will make or break the success of your transformation; an old PEG solution has had a chance to evaporate, so that the water to PEG ratio is off. If you can stand it, make new PEG for every transformation. Otherwise, make it in small batches, and seal tightly with parafilm between uses to minimize evaporation. 3. Using cells in stationary phase Cells in log phase, or exponential growth, take up DNA with much better efficiency. This is not to say that cells from a stationary culture can’t be transformed –only that your successful transformation rate will be much lower. Your best bet is to use cells that are growing rapidly at the time of transformation. 4. Using the wrong selective marker A stupid mistake, but one that I’ve made more times than I’d like to admit. Double check to save yourself some tears! 5. Cutting corners when heat-shocking This is a major difference between E. coli and yeast transformations: while E. coli is relatively delicate, and requires a heat-shock of less than a minute to take up DNA, the cell wall makes yeast more hardy and resistant to shock. Thus, for efficient transformation, yeast are generally heat-shocked for up to 45 minutes. I’ve gotten away with as little as 15 minutes, but any shorter and the transformation efficiency is drastically reduced. If you’re not in a hurry, let it go the whole 45 minut es, or you’ll get to experience the joy of doing it all over again.
毕赤酵母感受态制作及转化
毕赤酵母感受态细胞制作 1、GS115活化：100ml三角瓶中装入20ml YPD培养基，接种100ul菌保，过夜活化。 2、转接：500ml三角瓶中装入100ml YPD培养基，取1ml活化菌液接种到100ml YPD培养基中，培养至OD约为1.3-1.5。 3、收菌：将菌放置冰上15min，或者放于4°冰箱冷却。一般100ml菌液可以制备4份感受态细胞。将无菌水和过滤除菌的山梨醇（1M）提前置于4°冰箱冷却。 4、用100ml离心管收集菌体，4000rpm/min离心5min去除YPD培养基。 5、用20ml预冷的无菌水洗菌体，4000rpm/min离心5min，重复一次。 6、用20ml预冷的山梨醇洗菌体，4000rpm/min离心5min。 7、每个离心管中加入3ml预冷的山梨醇，重悬菌体。 7、将菌体分装至1.5ml灭菌离心管中，分装4管，4000rpm/min离心5min，弃上清。 8、每管加入80ul预冷山梨醇，重悬菌体，置于冰上待用或加入10%DMSO保存于-80冰箱。 毕赤酵母电击法转化 1、将感受态细胞在冰上融化，电转杯和山梨醇在冰上预冷。 2、将80ul感受态细胞与5-10ug线性化质粒混合，转移至0.2cm电转杯中，置于冰上5min。 3、根据电转仪选择合适的程序，进行电击。 4、电击后立即加入500ul预冷的山梨醇，将电击杯中液体全部转移至无菌的1.5ml离心管中，30℃水浴2h。 5、将菌体低转速离心5min，吸出多余上清，留100ul涂板即可。 6、将菌液均匀涂布于His缺陷型培养基，30℃培养1-2天。 要准备灭菌的有：水，1M山梨醇，滤器，大离心管，1.5ml离心管，大小枪头，所有的离心都是低温离心。
酵母双杂交操作步骤(中文翻译)
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念： 1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。 2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。 pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？ pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？ 各种SD培养基： 1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4) SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）
酵母转化
酵母转化（By HMM） 1.取50mL YPD液体培养基于100mL已灭菌的三角锥形瓶中，从中吸取1mL培养基于已灭菌的管，挑单克隆接种于1mL YPD培养基中，吹吸混匀（可再vortex继续混匀）后转移至50mL 的YPD液体培养基中，过夜培养约11h45min； PS: 晚上21:15开始准备，21:30接种完毕开始摇菌。（30℃ 250rpm）。 2.第二天早上9:15开始准备，取出1mL菌液用于测OD600，用1mL YPD培养基作为Blank. 9:30测完。 PS: a.要求OD600在至之间。 b.测完OD后打冰盒，将ssDNA置于冰上融化。 3.将菌液分装在2支50mL离心管（蓝色，无菌）中（锥形瓶留用），2500Xg常温离心5min.弃上清于之前的锥形瓶中，各用1mL灭菌ddH2O重悬转移至管中，共水洗两次，再各用1mL 灭菌ddH2O重悬后转移至同一个5mL无菌EP管中，吹吸混匀置于冰上。 PS：a.离心期间将灭菌水置于65℃烘箱中预热，将所需平板置于30℃培养箱中预热。 b.为避免菌液浓度差异，故将重悬后的菌液混匀，因重悬后体积大于2mL，因此转移至5mLEP管中，也可在2mL EP管中混匀后分装出一部分在一个管中。 4.待ssDNA溶化后根据所需量在无菌管中分装几管，各100uL（有助于煮沸后迅速冷却）。 PS: a. ssDNA要尽量多出一些，煮沸和转移过程中均有损失。 b.看ssDNA快融化时即可打开水浴锅，中频煮沸（800即可），煮沸ssDNA时用最低频120. 5.将ssDNA沸水浴5min, 然后迅速冰浴5min; PS：a.重复沸水浴5min与冰浴5min可提高转化效率。 b.冰浴ssDNA时将50％PEG与1M LiOAc也置于冰上。 6.在超净台中配制mix，vortex混匀。
[VIP专享]毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选
毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选 菌体的准备： 1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD 培养基的50ml 三角瓶中，30℃、250-300r/min 培养过夜； 2. 取100-500μl （≤1:100）的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、250-300r/min培养过夜(约20h)，至OD600 达到1.3~1.5； 3. 将细胞培养物于4℃，1500g 离心5min，用50ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬； 4. 按步骤3 离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬 5. 按步骤3 离心，用2-5ml，1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬； 6. 按步骤3 离心，用160μl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240 ul； 备注：可将其分装为80 μl 一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。 比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶BMGY摇瓶发酵。一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇，就类似BMMY的功能了。 ?KM71比GS115生长的要慢。毕赤酵母都应该是白色菌落的 ?对于LOX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入Cu2+ 离子，提高表达量和蛋白活性? 菌种保存： 挑单克隆到YPD中培养18-24h,然后取菌液以1:1加入30%灭菌甘油， -80o C ul/管冻存 （一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O重溶。转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。 乙醇沉淀主要步骤如下： 1）酶切体系（80ul）中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2 NaAC，混匀 2)-20℃ 20分钟沉淀 3)13200rpm，20min，离心后弃上清 4)75%乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清 5)37 度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。 6)20ul ddH2O重溶） 电击转化： 8. 将5~20 μ g 的线性化DNA 溶解在5~10 μ l TE溶液中，与80 μ l 的上述步骤6 所得的菌体混匀，转至0.2cm 冰预冷的电转化杯中； 9. 将电转化杯冰浴5min； 10. 根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击； 11. 电击完毕后，马上加入1ml 1M的冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml 的EP 管中；（置于30度摇床低速培养1h，再涂板） 12. 将菌体悬液涂布于MD平板上，每200~600 μ l 涂布一块平板； 13. 将平板置于30℃倒置培养，直至单个菌落出现（3-4天）。
酵母感受态的制备(化学法)
1、毕氏酵母氯化锂转化法 （1）试剂 1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释） 50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装） 2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存 注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用； （2）感受态毕氏酵母的制备 接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）； 收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min； 重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管； 离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中； 按50ul/管分装，立即进行转化； 注：不要将感受态酵母菌冰浴； （3）毕氏酵母的转化 煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA； 将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液； 对于每一个转化，按以下顺序加入： 50% PEG3350 240ul
1M LiCl 36ul 2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul 5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）； 30℃水浴孵育30min； 42℃水浴热休克20～25min; 6000～8000rpm离心收集酵母菌体； 重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育； 1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定； 2、毕氏酵母PEG1000转化法 （1）试剂 缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene gl ycol 缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35 缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35 未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存 注： 缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存; 将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）; （2）待转化毕氏酵母的制备
酵母重新转化及对照制备
酵母重新转化及对照制备(20181213) 背景： 前面酵母转化非常不顺，对照制备失败。这次置换Y2HGold菌株（from陆勇军老师实验室），重新转化相关质粒以及制备酵母筛库的对照。 实验设计： 实验流程： 1.复苏及培养酵母 1)提前三天划板(YPDA无筛选板)复苏酵母细胞Y2HGold、Y187，至30℃恒温培养箱生长3 天 2)将复苏的菌落挑单克隆至3ml YPDA液体培养基(15ml摇菌管) ，至30℃恒温摇床200rpm 摇8h 3)将5ul/10l培养物分别转入2个50mlYPDA液体培养基（250ml锥形瓶） 至30℃恒温摇床200rpm摇16-20h，至OD600=0.15-0.3 4)将培养物转至50ml离心管，室温离心700g 5min 5)弃上清，将沉淀的酵母细胞重悬，转至100mlYPDA液体培养基（250/500锥形瓶） 至30℃恒温摇床200rpm摇3-5h，至OD600=0.4 -0.5 2.制备酵母感受态 6)将上述培养物转至2个50ml离心管，室温离心700g 5min 7)弃上清，悬浮于30ml去离子水中（50ml离心管），室温离心700g 5min 8)弃上清，悬浮于3ml 1.1XTE/LIAC中，分装于两个1.5mlEP管中，每管高速离心15s 9)吸弃上清，把沉淀悬浮于600ul 1.1XTE/LIAC中 3.转化 10)在1.5mlEP管中加入相应质粒1000ng 10)加入5ul Carrier DNA（提前变性处理：95~100℃ 5min，冰上冷却） 11)加入50ul 酵母感受态细胞，温和混匀 12)加入500ul PEG/LIAC，温和混匀 13)放入30℃水浴锅30min 每15min摇一次 14)加入20ul DMSO，温和混匀 15)放入42℃水浴锅30min 每10min摇一次
毕赤酵母实验操作手册
毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。 与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，人们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外源基因表达的酵母宿主．1981年
酵母菌感受态制作及转化
Y187 酵母感受态制作及转化 1）挑新鲜单菌落Y187 于8 ml YPDA 培养液，30℃，250 rpm 培养16-18h；2）至OD600＞1.5，1：10 转接，此时OD600≈0.3； 3）30℃，250 rpm，4-7 h，每2 h 检测一次，直到OD600=0.4-0.6； 4）转入2 个50 ml 离心管，5100 rpm,5 min,弃上清； 5）加入1/2 V ddH2O,洗涤细胞，5100 rpm,5min,弃上清； 6）每管中分别加1 ml 1×TE/LiAc，冰上混匀，10000 rpm，15 s，去上清； 7）每管中分别加0.5 ml 1×TE/LiAc，冰上混匀，10000 rpm，15 s，去上清；8）每管中分别加0.5 ml 1×TE/LiAc，冰上混匀，10000 rpm，15 s，去上清；9）每管中分别加0.4 ml 1×TE/LiAc，每管100 ul 分装； 10）分别加入100 ng 左右DNA（plasmid）和0.1 mg 鲑鱼DNA（10 mg/ml,10 ul）,移液器抽吸混匀溶液； 11）分别加入600 ul LiAc/PEG，高速混匀（10 s-1 min 内）； 12）30℃摇床恢复30 min； 13）超净台（无菌条件下）加入70 ul DMSO,轻轻颠倒混匀； 14）42℃热激15 min； 15）冰上放置1-2 min； 16）14 000 rpm,15 s,去上清； 17）300 ul TE 重悬细胞； 18）100 ul/1 ul 分别涂布于YPDA 平板； 100 ul/1 ul 分别涂布于SD/-Trp 单缺陷平板； 100 ul/1 ul 分别涂布于SD/ -Trp/ -His 双缺陷平板上，30℃倒置培养48-72 h 可见转化菌落。
毕赤酵母表达系统使用心得
Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 + 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多 EasySelect Pichia Expression System 产品性能： 优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化 缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题
全面产品报告及心得体会： 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ 在多克隆位点（MCR ）3'端带有his-tag 和c-myc epitopes ，这些tag 有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor （α-factor ）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI ，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ 系列选用的是Zeocin 抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG 便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang ：pPICZ 系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K 还是pPICZ 系列？pPIC9K 属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ 系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用 抗Zeocin 筛选（PIC9K 操作麻烦一点，大肠用amp 抗性，而毕赤酵母先用His 缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD ）的蛋白在产量上是pPIC9K 无法比拟的。 leslie ：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有100KD ，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌pET 系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因为我的蛋白是人源的，表达出来用于酵母双杂，因此需要有完备的糖基化修饰）。这样我的DNA 片段由于较长，所以在做克隆的时候也要非常小心，需要注意的是： ①酶切位点不能出现在目的DNA 片段中——如果片段长无法避免，可以采用平末端连接； ②虽然α-factor 可以自动切除，但是在设计表达的时候，如果在N 端不能出现任何多余的aa （比如药物蛋白表达），需要特别留意（说明书上有详细说明：P13）； ③有三种不同的读码框（对于pPICZα系列来说就是对上α-factor 序列），在设计克隆的时候要反复确定自己的读码框是否正确，这可是致命的问题； ④无论pPICZ 还是pPICZα都有TGA （终止密码子），但是pPICZ 系列没有ATG （起始密码子），有人认为酵母启动
毕赤酵母常用培养基与载体
毕赤酵母常用培养基与载体 一、毕赤酵母表达常用载体： 典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中，而后再通过交换整合到受体染色体上。表达蛋白纯化方法：酵母系统表达的蛋白一般都具有活性，所以都采用较温和的纯化方式来纯化目的蛋白，分泌型表达的蛋白有利于纯化，可用硫酸铵沉淀，然后用离子交换，凝胶过滤层析，疏水层析等方法进一步纯化。具体的方法和操作应按所处理的目的蛋白的性质选择。 二．毕赤酵母表达的培养基配制和用途 2.1 LB（Luria－Bertani）培养基： Trypton l％ Yeast Extract 0.5％ NaCl l％ PH 7.0 制作平板时加入 2％琼脂粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存。用于培养pPICZ αA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。 2.2 LLB（Low Salt LB）培养基： Trypton l％ Yeast Extract 0.5％
毕赤酵母表达手册
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。 表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分 制作者：陈苗商汉桥