5个酵母电转化方案

5个电转化方案

方法一：高效

1.收集菌体

取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中，4℃、10000g 离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。

2.菌体处理

加入1ml处理液，室温下放置20min。

处理液：

10mM LiAc

10mM DTT

0.6M sorbitol

10mM TrisHCl(pH7.5)

3.离心，弃上清，加入1ml 1M sorbitol ，离心，弃上清，

4.用1M sorbitol洗涤二次，到最终体积约为80μl.（菌体太多可适当弃去部分）

5.加入10μl.经过BglⅡ酶切处理的工程质粒，混匀后转入电击杯中，冰浴5min.

6.电转. 1.5kv，25μF，200Ω条件下进行电转。

7.电击后立刻加入1mL 1M sorbitol，吸出后于30℃培养2h。

8.取一定量涂平板(YPDS + Zeocin，涂布的量分别为100、200微升，剩余的经离心处理后全部涂在一个平板上)

有一点要注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。

方法二：按下面步骤转化,开始每个板子只长了一二十菌落;小细节修改后,每个板长了约100个.

步骤如下：

1、目的DNA（pPIC9K)，经电泳检测已经线性化（SalI酶切）；

2、DNA纯化方法是经酚仿－氯仿两步抽提后，无水乙醇沉淀的，目测定量应足够；

3、GS115甘油菌经新鲜平板复苏后，5ML培养过夜，16h左右后，取菌1：100稀释，接种于70ml菌液扩大培养，14h后测得OD600约1.3左右。

4、将sorbital、水和菌液均冰浴；

5、菌液离心5min－100ml冰水洗涤－50ml冰水洗涤－4ml sorbital洗涤，然后溶解于300ul 冰sorbital；

6、加入约5～10ug的DNA，枪吹匀，置0.2CM电转杯静置5min；

7、电击，1,5KV.

8、立即加入1ml冰浴的sorbital，静止10min。

9、取100ul转化液，涂布10cm的MD平板。

做了一点修改每块板子大概能长100来个菌落（一般需要2天左右）：

1、菌液收集时间：以前可能是OD值测得不太准确，我然后把菌液分别做了1、

2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系。1、菌液测OD值时，建议将菌液稀释不同浓度测定，这样才准确些。菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能就是你的OD稀释倍数不够！你分别稀释2倍、4倍、8倍、10倍等，每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD 值是否准确！

2、我开始是先挑单克隆于5mlYPD中，过夜16h后，转接于50ml YPD中，培养大概18个小时吧。OD值是否测准可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心

5min）约0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。

3、电击条件等上面帖子上都有，1.5kv，放电4.8～5.5ms。

2、其它做法相同，就是感受态做好后，最后一次吸出sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。

3、最后用毛细管取出100ul出来，加入质粒，混匀！（我以前怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。）

4、MD板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。

5、你说的YNB，我用的是成品，只需要直接配制。42度水浴一会，然后过滤除菌。我没有加硫酸铵。YNB是加到培养基里面的，去离子水pH偏低哦，我建议直接用蒸馏水就可以了（关系不是太大）。

方法三：简便独特

在筛选高表达菌种中，与大多数人和说明书有区别(成功做出几个基因):

每次转化前，均用多种酶BlgII/salI/sacI同时切，转化时，用GS115/KM71/KM71H同时转化，转化的条件也和大家一样，即1.5/25/200,但是我用的是0.1的杯子，不是0.2的，转化后涂MM及YPD+0.25G，长出菌落后，即进行大规模的表达试验，直接用YPD表达的，一般48h后即进行大量的SDS-PAGE鉴定，鉴定时，样品不用浓缩，直接上样，看到目的带后再做PCR，测序。

方法四：没有转化子（无aa的YNB和硫酸铵称好后，去离子水溶解，然后高压灭菌）

1.挑取酵母单菌落，接种至含有50ml YPD培养基的三角瓶中，30℃、250-300rpm培养过夜约14h，OD600约1.3

2.菌液离心5min－50ml冰水洗涤－25ml冰水洗涤－2ml sorbital洗涤，然后溶解于200ul 冰sorbital；两管分装，每管100ul

3.加入约5～10ug的线性化的DNA20ul，枪吹匀，置0.2CM电转杯冰浴5min；

4.电击，1,5KV.使用的是Eppendorf 2510，用于转化细菌及酵母。

5.立即加入1ml冰浴的sorbital，静止1h。

将菌体悬液涂布于MD平板上，每300µl涂布一块平板；

方法五: 和Invitrogen公司说明书差不多的方法

X33菌株于100ml YPD摇到OD600约1.1-1.3，太高影响感受态效率

(1) 1500－1700g离心5min，将离心管倒置在吸水纸上轻轻控几下，充分弃上清

(2) 加入100ml 冰浴的超纯水ddH2O，可在振荡器上振荡混匀，可静置3－5分钟

(3) 离心，弃上清，再加100ml ddH2O洗一遍

(4) 离心，弃上清，加20ml 冰浴1M Sorbitol洗一遍

(5) 离心，弃上清，菌体置于冰浴中，加入约100－200ul Sorbitol混匀

加入Sorbitol量需自己调整，这时菌液很浓，只要能够用200ul黄枪头吸出来就可以了，一般共有约400－500ul，够做几管感受态了。

(7) 吸取100－150ul感受态到线性化的DNA中，用枪头打匀或手指弹匀

静置5min，于2mm电转化杯中，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400），一般放电时间在4.5-4.9ms之间，小于4说明你的DNA盐浓度太高

(9) 立即加入1ml Sorbitol，转入10ml 离心管，30度静置1小时，然后加入1ml YPD，30度，200rpm摇1小时，取50－200ul菌液涂100ul/ml YPDS板

(10) 一般转化效率可以达到：200个以上转化子每200ul菌液，足够筛选表达菌株了。

方法六:酵母感受态细胞的制备

⑴接种Pichia pastoris GS115于5 ml YPD液体培养基，30℃，250~300250 rpm ，过夜。