生物选修一大肠杆菌的培养和分离

★ 不耐高温的液体成分： G6玻璃砂漏斗滤过除菌
3.无菌环境
细菌检验的操作需在无菌室或超净工作台内进 行。 无菌室、超净工作台使用前后需进行消毒。 细菌检验使用的物品使用前后需严格灭菌 标本的采集 无菌试管、烧瓶的使用
4.接种前准备
用肥皂洗手并使用酒精消毒。 点燃酒精灯 →酒精棉擦拭双手 →酒精棉擦拭桌面
大肠杆菌培养基：一般用LB液体培养基来扩大培养大 肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线分离。
大肠杆菌菌液（LB液体培养基） LB固体培养基
大肠杆菌的扩大培养
将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的 液体培养基中,使其在37℃摇床培养12小时。
注意事项:
好氧型
1.火焰旁从斜面上用接种环取菌;
2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧
第一部分 :微生物的利用
一、基础知识
1微生物 2培养基
3无菌技术
二、实验操作
1操作步骤 2微生物的接种技术
一基础知识
（一）微生物
病毒
病毒界
细菌和蓝细菌
真菌
微生物包括哪五类： 放百度文库菌
真菌界
原核 生物界
原生动植物 原生生物界 特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通 常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有 的甚至没有细胞结构.
按化学成分来分
人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生 长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。
血清中含有： ①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子； ③激素； ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分
不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方 细菌喜荤，霉菌喜素
菌落：
• 单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖 时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定 形态结构的子细胞群体，叫做菌落。 • 菌落是鉴定菌种的重要依据。
菌落
细菌的菌落特征 因种而异
细菌的营养物质
• • • • • 碳源 有机 、无机 氮源 有机 、无机 水 无机盐 生长因子 即细菌生长必需，而自身 不能合成的化合物,如维生素、某些氨 基酸、嘌呤、嘧啶
灭菌,冷却后方能取菌;
3.取菌后封口膜和棉塞复原.
二、无菌技术
从制备培养基到接种与培养等全部实验 过程要无菌操作
• （1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清 洁和消毒 ； • （2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行 灭菌 ； • （3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精 灯火焰附近进行； • （4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接 触。
培养基种类
物理状态
•液体培养基 •固体培养基
化学成分
•合成培养基
目的用途 •选择培养基 •鉴别培养基
•半固体培养基
•天然培养基
按物理状态来分
液体培养基：
表面生长
均匀混浊生长
沉淀生长
用途：工业生产、扩大培养
固体培养基：菌落，菌苔
按物理状态来分
保 存 菌 种
用途：菌种分离、鉴定、计数
半固体培养基：
细菌的外形与大小
细菌：单细胞不分枝的原核微生物。 细菌细胞微小而透明，通常用适当染料染色 （革兰氏染色）后显微镜观察
革兰氏染色
• 革兰氏染色是一种用于细菌的染色法。
• 革兰氏阳性菌 • 革兰氏阴性菌
用革兰氏染液染色后，再用脱色液处 理，细菌仍保留染色液的颜色 相反
细菌的构造
细菌细胞由外向里 依次有鞭毛、菌 （纤）毛、荚膜、 细胞膜 细胞壁、细胞膜、 拟核 细胞质、 拟核， 细胞质中又有液 泡、储存性颗粒、 核质等。
1-1什么是生物技术
• 生物技术=生物工程
应用自然科学及工程学原理，以微生 物体、动物体、植物体或其组成部分作为 生物反应器将物料进行加工，以提供产品 来为社会服务的技术。
1-2 传统生物技术
• 传统生物技术指主要通过微生物 的发酵来生产商品.如:酱、醋、 酒、面包、奶酪、酸奶等
1-3 现代生物技术
按物理状态来分
无动力
有动力(弥散)
观察细菌的运动、厌氧菌的分离和菌种鉴定
1．液体基础培养基 牛肉膏0.3g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g ，蒸馏水100ml， 加热溶解以上成分，冷至40-50℃，调pH值至7.4~7.6， 煮沸3-5分钟，补足水分，过滤、分装、高压灭菌。 2．半固体基础培养基 在液体基础培养基100ml中加琼脂0.2-0.5g，加热至 100℃使琼脂熔化，分装试管，高压灭菌。取出后直立 放置至琼脂凝固。 3．固体基础培养基 在液体基础培养基100ml中加琼脂2-3g，加热至100℃使 琼脂化，分装于试管和三角烧瓶中，高压灭菌。取出后 趁热将试管倾斜一定角度放置，琼脂凝固后即成普通琼 脂斜面；将三角烧瓶中培养基倾注于灭菌平皿内，凝固 后即成琼脂平板基础培养基。
选择培养基
按功能来分
——添加或缺少某种化学成分用于菌种的分离 加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物 加入青霉素等抗生素的培养基: 分离导入了目的基因的受体细胞
鉴别培养基
二、发酵工程
–微生物的无氧呼吸叫发酵 –1.定义：利用DNA重组技术对不同生物 的遗传基因，根据人们的意愿，进行基 因的切割、拼接及重新组合，再转入生 物体內，产生出人们所期望的产物或创 造出具有新的遗传特征的生物类型。
三、蛋白质工程
–蛋白质工程主要包括了解合成蛋 白质的DNA编码序列、蛋白质的分 离纯化、蛋白质的序列分析和结构 功能分析、蛋白质结晶和结构力学 分析等。
大肠杆菌的培养与分离
实验目的:
1.进行大肠杆菌的扩增，利用LB液体 培养基进行细菌培养的操作 2.进行大肠杆菌的分离,用固体平板 培养基进行细菌的划线培养 3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要 求的原理
对链霉素敏感
大肠杆菌基础知识：
由于细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌 和革兰氏阴性菌。
• • • • • • 一般而言，現代生物技术可以分成以下五种： 一、细胞工程 二、发酵工程 三、蛋白质工程 四、酶工程 五、基因工程
现代生物技术与传统生物技术的本质区别是 现代生物技术中用到了基因工程。
一、细胞工程
按照人们的需要和科学设计改变 细胞的遗传基础，并通过细胞(组 织)培养，细胞杂交(融合)，核移 植和胚胎移植等技术，重组细胞 的结构和内含物，以改变生物的 结构和功能，快速繁殖和培养出 人们所需要的新物种的生物工程 技术。
b 干热灭菌
160－170℃ ；1－2h 能耐高温的需要保持干 燥的物品( 玻璃器皿)
C 高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min
通常用于培养基、无菌水的灭菌
• 补充：表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线 灭菌法，所用器械是紫外灯
培养基灭菌
★ 基础培养基： 121℃高压蒸汽灭菌15分钟 ★ 含糖培养基：90℃以上灭菌30分钟 ★ 鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次
对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒碳酸和煤酚皂等溶液以 增强消毒效果，然后用紫外线进行物理消毒
（2）灭菌
① 概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的 微生物，包括芽孢和孢子。 ② 方法：a 灼烧灭菌 b干热灭菌 c 高压蒸汽灭菌
a 灼烧灭菌
微生物的接种工具 (接 种环、接种针)或其他 金属用具直接在火焰的 充分燃烧层灼烧
伊红—美蓝鉴别大肠杆菌
按功能来分
添加某种指示剂后化学药剂用于菌种的鉴别
当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电 荷被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色菌 落，并带有绿色金属光泽。常用的伊红美蓝 乳糖培养基，可用来鉴别饮用水和乳制品中 是否存在大肠杆菌等细菌
大肠杆菌菌落
伊红美蓝培养基
按化学成分来分
天然培养基：
图 细菌的结构
*细胞壁
• 成分：肽聚糖 • 细胞壁有哪些功能？ • ①固定细胞外形；

②保护细胞免受外力的损伤； ③阻拦大分子物质进人细胞； ④使细胞具有致病性及对 噬菌体的敏感性。
伤 寒 杆 菌 细 胞 壁 中 含 毒 素
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠 体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环 境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才 死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水 分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.
一旦划破，会造成划线不均匀，难 以达到分离单菌落的目的； 二是存留在划破处的单个细胞无法 形成规矩的菌落，菌落会沿着划破 处生长，会形成一个条状的菌落。
恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒 放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放， 则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养 皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌 落，达不到分离目的。
细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素。 革兰氏阳性菌：
对青霉素更为敏感。 细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素 革兰氏阴性菌：
大肠杆菌是革兰氏阴性菌，异养兼性厌氧型肠道杆菌。在肠道 对人无害，但进入人的泌尿系统便会产生危害。大肠杆菌在基 因工程中广泛应用，它的质粒是最常用的载体，也是基因工程 中常用的受体细胞。
1
1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他 外来微生物污染外，还有什么目的？
答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。 如果需要，请选择合适的方法。 （1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手
四、酶工程
酶工程即利用基因工程等手段，改 变酶或蛋白质的折叠方式、空间结 构、催化活性和稳定性等
选修1需学习的实验
（微生物的利用） 实验1 大肠杆菌的培养和分离 （酶的应用） 实验4 果汁中的果胶和果胶酶 实验5 加酶洗衣粉的使用条件和效果 实验6 α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的 检测 （生物工程在食品加工中的应用） 实验8 果酒及果醋的制作实验 实验10 泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定 （浅尝现代生物工程） 实验11 植物的组织培养
大肠杆菌的培养和分离
培养基的配 制
灭菌 超净工作台 倒平板 接种液体 培养
菌种保存
分离 培养
一、大肠杆菌的培养
培养基是人工配制的适合微生物生长繁 殖或积累代谢产物的营养基质。
能源 碳源 氮源
矿质 元素 生长 因子
水
大肠杆菌培养基：一般用LB液体培养基来扩大培养大 肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线分离。
天然培养基有血清、血浆、和组织 提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限;成分复杂，影响对某 些实验产物的提取和实验结果的分析; 易发生支原体污染;
合成培养基:
按化学成分来分
根据细胞生存所需物质的种类和数 量，用人工方法模拟合成的。 合成培养基主要成分是氨基酸、维 生素、碳水化合物、无机盐和其它一 些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相 对固定;成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满 足体外细胞生长需要。
大肠杆菌配方：酵母提取物：0.5g 琼脂 ： 1g 水:50ml 蛋白胨：0.5g Nacl：0.5g
细菌喜中性偏碱，霉菌喜中性偏酸
不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮 源、 无机盐、生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合 成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)等营养物质， 另外还需要满足微生物生长对pH 、氧气、渗透 压的要求．
答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
实验流程
三、大肠杆菌的分离
包器材 菌种扩增 灭菌
配制培养基
倒平板 接种、划线 培养 观察记录
倒平板
接种、划线
灼烧接种环 →取菌液 →划线分离
烧至暗红
接种、划线
灼烧接种环 →取菌液 →划线分离
菌液膜
接种、划线
1、划线分离法
① ② ④ ③
为什么通过划线分离可得到单菌落？ 每划完一个区域要不要灼烧接种环？
获得纯净培养物的关键: 防止外来杂菌的入侵
消毒与灭菌
(1)消毒： 概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表 面或内部一部分对人体有害的微生物。包括芽孢和 孢子吗？
不包括
消毒的方法：
1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min（日常生活常用）
2、巴氏消毒法：70-75 ℃下煮30min或 80 ℃ 下煮15min （对一些不耐高温的液体，常用于鲜奶的消毒） 3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进 行皮肤消毒;氯气消毒水源（双手使用酒精消毒） 4、紫外线消毒