土壤酶活性测定的实验步骤

土壤酶的测定

1．三角瓶用稀HNO3（3-5%）或用洗衣粉浸泡24h，后刷洗，然后再用蒸馏水润洗，晾干。2．土样研磨精细后分袋装好。土量需2g+2.5g+5g+5g=14.5g ，重复一次，14.5×2=29g。

一、过氧化氢酶（容量法）（关松荫P323）

1．试剂配制：

(1)0.3%过氧化氢溶液：

①（1：100 30%的H2O2和水）

②（0.5molH2O2+49.5ml蒸馏水）

③（1ml30% H2O2+99ml蒸馏水）

(2)3N硫酸：（10ml硫酸+50ml水）

(3)0.1N高锰酸钾溶液：（1.58gKMnO4+100ml蒸馏水）

2．操作步骤：

2g风干土置100三角烧瓶→注入40ml蒸馏水和5ml 0.3%过氧化氢（现配）→在往复式振荡机上振荡20min→加入5ml3N硫酸（以稳定未分解的H2O2）→用慢速型滤纸过滤，→吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾的滴定至淡粉红色

3．结果计算

过氧化氢酶的活性（M），以20min后1g土壤的0.1N KMnO4的毫升数表示：

M=（A－B）×T

式中：

A：空白消耗的0.1N KMnO4 毫升数

B：滤液消耗的0.1 N KMnO4 毫升数

T：KMnO4滴定度的校正值

备注：

以容量法测H2O2的酶活：Kappen（1913）首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活。此法根据H2O2与土壤相互作用时，未分解的H2O2的数量用容量法（常用高锰酸钾滴定未分解的H2O2）测定H2O2的酶活

2 KMnO4＋5H2O2＋3H2SO4→2MnSO4＋K2SO4＋8H2O＋5O2

土壤H2O2酶促过氧化氢的分解有利于防止它对生物体的毒害作用

二、蔗糖酶（P278）滴定法

1.试剂配制：

(1)20％蔗糖：（20g蔗糖＋80ml水或12.5g蔗糖＋50ml水）

(2)甲苯(分析纯)

(3)PH5.5醋酸盐－磷酸盐缓冲液

0.5ml磷酸氢二钠·12 H2O(1/15M) + 9.5ml 磷酸二氢钾（1/15M）

磷酸氢二钠·12H2O(1/15M) ：23.88g Na2HPO4,，加H2O溶解，定容至100ml。

磷酸二氢钾（1/15M）：9.072g KH2PO4，加H2O溶解，定容至1000ml。

(4)33%KI溶液（4.925g+10ml水）现配，冰箱遮光

(5) H2SO4（1：3）（体积比）：15ml 98%H2SO4 + 45ml蒸馏水

(6)淀粉指示剂

取0.5g淀粉溶于少许水中，加10ml煮沸的2.5%NaCl液煮沸1min。

（2.5%NaCl：2.5g NaCl加97.5ml蒸馏水。）

(7)0.1NNaS2O3 滴定液

取25克-----溶解于刚煮沸而冷却的蒸馏水中，加入少量的碳酸钠，稀释至1升。(8)菲林溶液

取3.464克CuSO4·5H2O溶于蒸馏水，并稀释至50ml（a）,取17.3g酒石酸钾钠和5gNaOH 溶于蒸馏水，并稀释至50ml（b），使用前将（a）（b）按1：1混合。

2.操作步骤

取 2.5g土置于100ml三角瓶→用0.375ml甲苯处理15min。加 2.5ml 20％蔗糖和2.5mlPH5.5醋酸铅－磷酸盐缓冲液摇匀后放在37度恒温箱中培养24h。

培养结束后，加12.5ml蒸馏水。

摇荡后过滤，取5ml的滤液移入100ml三角瓶中，加2.5ml的菲林溶液，在沸水浴上放置10min，冷却至室温后，再加0.75ml 33%KI溶液和1ml H2SO4（1：3）。加入淀粉指示剂2滴，然后用0.1NNaS2O3 滴定。

颜色：棕色→棕蓝色→乳白色（滴定结束）

注意：减量滴定，一般取5ml即可，滴定需NaS2O3溶液（大量）

空白对照：30.15ml（取5ml时）

3．结果计算：

蔗糖酶活性（M），用对照与试验的0.1NNaS2O3滴定量毫升数之差表示。试验应设以水20毫升代替基质。

M=（A－B）×T×17.875/5/2.5

式中：

A：对照所消耗的0.1NNaS2O3 毫升数

B：滤液所消耗的0.1NNaS2O3毫升数

T：NaS2O3 滴定度的校正值

×17.875/5/2.5：换算成1g 土消耗的0.1NNaS2O3 量

1.试剂配制

(1)PH=6.7柠檬酸盐缓冲液

取3.68g柠檬酸溶液于6ml蒸馏水中，另取2.95g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将PH调至6.7，并将水稀释至20ml 。

(2)苯酚钠溶液

称62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，然后用乙醇稀释至100ml （A液），存于冰箱中。

称27gNaOH溶于100ml水中（B液），存于冰箱中。

使用前，取A,B两液各20ml混合，并用蒸馏水稀释至100ml备用。

(3)次氯酸钠溶液

用水稀释制剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

（17.3mlNaClO定容至100ml）。

(4)10%尿素液

10g尿素＋90ml水

50g尿素＋450ml水

(5)甲苯

(6)氮的标准溶液（不要配）

精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，则得1ml含0.1mg氮的标准液。绘制氮的标准曲线时，可将此液稀释10倍供用。

2.操作步骤

取5g风干土，至于50ml三角瓶中，加1ml甲苯。15min加10ml 10%尿素液和20mlPH6.7柠檬酸缓冲液。摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。

过滤后取3ml滤液注入50ml锥形瓶中，然后加蒸馏水20ml，再加4ml苯酚钠溶液和

3ml次氯酸钠溶液，边加边摇匀。

20min后显色，定容50ml：1h内在分光光度计上于波长578nm处比色。然后按绘制标准曲线（显色方法）进行比色测定。

3．结果计算：

脲酶活性（M）以24h后1g土壤中NH3－N的毫克数表示

M=x×31/3/5

标准曲线：y=0.0268x+0.001804

即：M=（0.001804-y）×31/3/5/0.0268

式中：

x：从标准曲线查得的NH3－N毫克数

y：578nm处吸光度

×31/3/5：换算成1g土的系数