利用基因芯片进行基因表达谱分析

• 假阴性：一般不关心，但也要看实验目的 • 假阳性：验证 • 基因芯片结果需要传统方法的验证
新一代芯片技术 光纤微珠芯片
Screening Unlabeled DNA Targets with Randomly Ordered Fiber-Optic Gene Arrays,
Steemers, F.J., Ferguson, J.A., Walt, D.R., Nature Biotechnology,18, 91-94, 2000. Techview: Molecular Biology. Bead-Based Fiber-Optic Arrays, Walt, D.R., Science, 287,
• 根据杂交结果判断待测样品同芯片上哪个 片段结合，通过与对照组的比较转化成基 因表达的改变
单荧光系统芯片的原理及流程图
探针A：biotin标记
杂交
探针B：biotin标记
扫描
两张芯片上 相同位点信 号比
数据分析、寻找差异表达的基因
单通道和双通道的比较
• 单通道实验结果重复性更好，使得比较不 同样品之间各种基因表达的相对比例是可 靠的。进行多个样品之间（芯片之间）的 比较时，只需在多个样本中设置对照。由 于点样的是寡核苷酸，探针无法检测。
• 加入RNase H，水解掉RNA模板，以残留的与 cDNA一链配对的短片段RNA为引物，在DNA聚 合酶的作用下生成双链cDNA
噬菌体T7 DNA编码的酶， 对T7启动子序列具有高
度特异性，m不能R识N别A其
它生物来源的启动子。
是依赖于DNA的RNA聚 合酶，具有5'→3'的RNA 聚合酶活性，以含有T7 启动子序列的双链DNA 为模板，以NTP为底物，
• 洗片，扫描检测 • 杂交量依赖靶DNA和探针的浓度，当靶DNA浓
度一定时，荧光信号强度在一定范围内与探针量 成线性关系
RNA相对不稳定
Array
RNA:DNA Hybridized Array
Fragmented cRNA Target
Streptavidin phycoerythrin [Fluorescent dye]
光纤微珠芯片---技术原理
寡聚核苷酸探针
• 双通道（点样cDNA）重复性相对较差，但 是探针可以测序验证。双色法需在每次杂 交检测中设置对照，只能进行两个样品之 间的比较，芯片之间的比较并不可靠
Expression Analysis Arrays （Affymetrix)
Unique PM-MM Probe Design
5´
3´
AAAAA
逆转录：合成cDNA一链
• mRNA逆转录合成cDNA时用poly（dT）作 引物，可以直接用总RNA作为摸板进行逆转 录标记，简化步骤，减少mRNA的损失，从 而减少对组织的需求，也避免了从总RNA中 纯化mRNA的工作
• 总RNA的纯度不如mRNA高，直接从总RNA 进行mRNA的逆转录在一定程度上会影响到 逆转录标记的效率，需要尽可能保证总RNA 的纯度
杂交过程
影响杂交速率和杂交双链稳定性的因素 1．核酸浓度 2．探针的类型和长度 3．碱基组成 4．杂交液成分 （1）离子强度 （2）Formamide （3）季铵盐溶液 （4）杂交加速剂 5．不匹配序列 6．杂交时间 7．杂交温度
原核生物样品
数据分析流程图
原始图象文件(Cy3/Cy5) →定位 →栅格处理(griding)→数据自动提取
利用基因芯片进行 基因表达谱分析
第三讲
基因芯片应用
• RNA的检测: 表达丰度，剪切体 • DNA的检测：SNP，CGH，Methylation • cDNA 芯片的主要用于：表达谱芯片，CGH • 寡核苷酸芯片主要用于：诊断芯片，SNP分型芯
片
More Microarray Applications
混合探针
Cy5标记的B组织mRNA
杂交
以两种波长的激光扫描 Cy3-532nm Cy5-635nm
数据分析、寻找差异表达的基因
单色荧光系统
• 较短的寡核苷酸芯片如Affymatrix芯片； 载有较长片段的寡核苷酸芯片也可使用， 如Illumina芯片
• 实验组和对照组分别用同样的荧源自文库物质标 记（或生物素biotin），分别与芯片杂交， 即一张芯片只杂交一个样本
核苷酸的修饰方法
• 生物素标记的dNTP ： 利用biotin-Streptavidin phycoerythrin [Fluorescent dye]的结合进行检测， 标记探针稳定，不失活，并能配用多种检测系统，简 单方便，扫描成本较低。
• 荧光素标记的dNTP：Cy3-的dNTP ，Cy5-的dNTP • 同位素标记的dNTP • amino allyl （氨烯丙基）NTP ：便宜，掺入DNA和
标记
mRNA Reverse Transcriptase
cDNA in vitro transcription
cRNA
Fragmentation of cRNA GeneChip Hybridization
实验过程
• 样本制备 • 样本标记 • 预杂交 • 杂交 • 洗涤 • 染色（如生物素
标记） • 扫描 • 数据分析
451-452, 2000 Decoding Randomly Ordered DNA Arrays, Kevin L. Gunderson, Genome Research,
14: 870-877, 2004.
光纤微珠芯片---技术原理
微珠
3.1 um无孔无荧光 硅珠
每个微珠单独质控
•有效的反应表面积和体积比 •低/无背景 •大小均一
cDNA的过程中分别标记上Cy3和Cy5两种荧光， 制备成探针，竞争性地与芯片上的核酸片段进行 杂交
• 两种波长的激光扫描读取竞争杂交的结果，通过 计算机处理就能确定芯片上基因所结合探针的量， 通过计算两种荧光强度的比值来判断两种组织中 基因表达是否有变化。
双荧光系统芯片的原理及流程图
Cy3标记的A组织mRNA
Hybridization process of GeneChip
LL L
Labeling cRNA
fragment
LL
Control Oligo B2
Eukaryotic
Hyb.Control
Hybridizatio n mixture
hybridization
（16hour）
Data analysis
合板D成N与A启互动补子的c下RRN游NA的A。模
Fragmentation of biotinylated cRNA
芯片杂交
• 将靶分子变性后，用预杂交液与芯片进行预杂交 1小时左右（ cDNA和长链寡核苷酸，42度（50 ％甲酰胺）；短链寡核苷酸，50度）
• 杂交：温度同预杂交，标记好的样品与杂交仓内 反应14-18小时
• RNA样本扩增后进行标记
扩增mRNA（cRNA）靶分子
• 联合应用cDNA扩增和模板指导下的体外转录反应 来完成线性扩增。
• PCR方法： 同一用量和限制循环次数的条件下，通过RT-PCR 可平行的扩增实验组和对照组的RNA样本以满足 实验要求并同时进行荧光标记。
扩增mRNA（cRNA）靶分子
mRNA的纯化方法
• 两步法：从样本中制备总RNA，再从总RNA中分 离mRNA, 总RNA中包括rRNA、tRNA和mRNA， 其中９０％以上是rRNA和tRNA，分离mRNA的 原理一般利用真核生物的mRNA的３’端都有 polyA尾，用poly（dT）-纤维素亲和层析纯化 mRNA。
• 一步法：从组织样本中直接用poly（dT）-纤维 素亲和层析纯化mRNA，这种方法简便，但RNA 的纯度不够，当组织量少或对RNA质量要求不高 时可采用
→数据入表达谱数据库
→原始数据标准化(normalization)
Ratio值分析
Cluster分析
显著性表达差异基因 具有相似表达谱基因
Experiment group/control :
信号叠加图
Hepacellular carcinoma/Normal liver
Red: 明显上调 Yellow: 差异不显著 Green: 明显下调
• 荧光标记：标记分子在特定的波长范围被激光光 源激发出荧光，从而对含有标记分子的样本进行 检测。如花青素（Cyanin）Cy3、Cy5，其激发 和发射波长分别为：550/570和649/670。大部分 扫描仪都能对这两种荧光标记进行图像处理。这 种标记方法没有同位素标记的限制；而且具有极 高的灵敏度，能够进行定量检测
RNA链的效率与未标记的NTP相同；检测的时候只 需在它的氨基反应基团上偶联Cy系列的染料或其他 染料；但实验误差大
标记方法
• RNA样本不扩增进行标记：在反转录的体 系中加入Cy3或Cy5标记过的dNTP类似物， 通过反转录酶的作用，标记新合成的cDNA。 这种实验方法效率较低，对RNA样本需求 量大，通常要50～200μg总RNA，1～3μg mRNA
DNA
RNA
aCGH
SNPs
ChIP/LA
Gene Expression
Alternate Splicing
miRNA
Chromosomes DNA Gene promoters mRNA mRNA variants microRNAs
双色荧光系统
• cDNA芯片技术及载有较长片段的寡核苷酸芯片 • 实验组及对照组两种组织的mRNA在反转录成
• 基于T7的mRNA线性扩增：利用模板指导 下的体外转录反应来完成线性扩增。该方 法能从1～50ng mRNA分子出发扩增出足 够数量的cDNA靶分子。这种扩增方法更具 线性
合成cDNA二链
• 在小鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶的作用下， 反转录生产cDNA一链。MMLV反转录酶会在 cDNA一链的3’端加上非模板的寡聚C残基，这时 加入3’端带有寡聚G的引物，可以结合到cDNA的 3’端，生成一小段双链的cDNA，再在DNA聚合 酶的作用下延伸形成
样本量
• 从多少总RNA中进行逆转录才能满足实验 需要？非扩增：20微克；扩增：1微克
• 有些情况下，样本极为稀有，不可能得到 大量的mRNA靶分子
• 基因芯片实验对总RNA量的需求在一定程 度上限制了该技术的推广
• 发展方向：提高检测灵敏度，减少基因芯 片实验样本用量
核苷酸的修饰方法
• 荧光标记：需避光，合成效率低，不同的荧光修 饰会影响标记效率，如Cy3标记的和Cy5标记的 NTP掺入到DNA和RNA链中的效率是不一样的； 最终也导致成本高
oligonucleotide
PM-MM探针设计的优势
• 灵敏度的提高
将已克隆的转录产物 以不同的浓度掺入到组 织样品中。经过标记的 样品与Affymetrix Genechip人类基因组 芯片杂交，在克隆转录 产物浓度低于8pM时， PM单独探针无法探测 出相应的浓度变化，而 与MM探针联合使用则 可以探测出。
单链和双链探针
• 双链探针在液相条件下自我复性从 而大大降低与固着的靶DNA杂交 的机会，从而降低了探测灵敏度， 因此需更多的探针量。
• 单链，使杂交灵敏度提高
基因芯片实验流程及方法
cDNA microarray
TWO CHANNEL MICROARRAY
Affymetrix Expression Analysis
Scan
Wash & stain
样本制备
• 表达谱基因芯片研究的对象是样本中的 mRNA，抽提出的mRNA需要经过反转录 酶的作用转变为cDNA，同时进行荧光标记， 标记好的cDNA靶分子就可用于杂交。
• 基因芯片实验中的RNA抽提大都采用分子 生物学中传统的方法，但要求必须能够尽 可能多的抽提出组织中的RNA分子，保持 实验数据信息与组织中mRNA拷贝数信息 之间的平行性。
3’UTR
11-20 pairs of 25mer probe
Probe Pair
Perfect Match Mismatch
Probe cell or feature
Chip
• Each gene is represented on the probe array by multiple probe pairs • Each probe pair consists of a perfect match and a mismatch